(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210985725.5 (22)申请日 2022.08.17 (71)申请人 中国农业大 学 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 (72)发明人 段长青　齐梦瑶　黄勇策　石英　 兰义宾　 (74)专利代理 机构 北京轻创知识产权代理有限 公司 11212 专利代理师 牟森 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 27/447(2006.01) (54)发明名称 一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾 液及单宁含量的测定方法 (57)摘要 本发明涉及葡萄酒检测技术领域， 具体而 言， 涉及一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工 唾液及单宁含量的测定方法。 该人工唾液中包括 α‑淀粉酶、 聚 ‑L‑脯氨酸、 乳铁蛋白、 溶菌酶、 牛 血清蛋白 以及人工唾液缓冲液； 能够模拟真实唾 液离子环 境， 灵敏度高、 浓度稳定， 在对葡萄酒中 的单宁进行测定时， 具有良好的稳定性和可重复 性。 本发明的方法建立单宁含量与人工唾液中的 各蛋白的蛋白损失率的线性方程， 并采用液相色 谱法单独检测聚 ‑L‑脯氨酸， 使本方法灵敏度高、 准确度好、 可重复性 好。 权利要求书2页 说明书9页 附图1页 CN 115480003 A 2022.12.16 CN 115480003 A 1.一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液， 其特征在于， 所述人工唾液中包括α ‑ 淀粉酶、 聚 ‑L‑脯氨酸以及人工唾液缓冲液。 2.根据权利要求1所述 一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液， 其特 征在于， 还包括乳铁蛋白、 溶菌酶、 牛 血清蛋白； 所述乳铁蛋白的浓度为0～200mg/L， 所述溶菌酶的浓度为0～50mg/L， 所述α ‑淀粉酶的 浓度为300～500mg/L， 所述牛血清蛋白的浓度为0～250mg/L， 所述聚 ‑L‑脯氨酸的浓度为 100～300mg/L。 3.根据权利要求2所述一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液， 其特征在于， 所述 乳铁蛋白的浓度为145.7mg/L， 所述溶菌酶的浓度为19.3mg/L， 所述α ‑淀粉酶的浓度为 425.8mg/L， 所述牛 血清蛋白的浓度为10 3.2mg/L， 所述聚 ‑L‑脯氨酸的浓度为23 3.6mg/L。 4.根据权利要求1～3任意一项所述一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液， 其特 征在于， 所述人工唾液缓冲液的组分及各 组分的浓度为， 5.208g/L碳酸氢钠， 1.369g/L三水 合磷酸氢二钾， 0.87 7g/L氯化钠， 0.47 7g/L氯化钾以及0.4 41g/L二水合氯化钙， 溶剂为水。 5.根据权利要求1～3任意一项所述一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液， 其特 征在于， 所述人工唾液的pH值 为6.5～7.5 。 6.一种采用权利要求1～5任意一项所述的人工唾液对葡萄酒中单宁含量的测定方法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1、 建立单宁含量与所述人工唾液中各蛋白的蛋白损失率的线性方程； S2、 将所述人工唾液与待测酒样按照8:1的体积比混合， 并在37℃孵育， 孵育后离心并 保留样品上清液； S3、 采用与步骤S2相同的方法将所述人工唾液与蒸馏水混合， 并得到对照上清液； S4、 采用液相 色谱法分别检测所述样品上清液和所述对照上清液中的聚 ‑L‑脯氨酸的 含量； 采用电泳法分别检测所述样品上清液和所述对照上清液中各蛋白的含量； S5、 根据检测到的蛋白含量计算所述样品上清液中各蛋白的蛋白损失率， 并带入所述 步骤S1的线性方程中， 计算得到待测酒样中的单宁含量； 蛋白损失率的计算公式为： 蛋白损失率＝(对照上清液中蛋白含量 ‑样品上清液中蛋白 含量)/对照上清液中 蛋白含量。 7.根据权利要求6所述一种葡萄酒中单宁含量的测定方法， 其特征在于， 所述步骤S1 中， 所述线性方程的建立方法包括以下步骤： S1‑1、 配制多个浓度梯度的单宁标准溶 液； S1‑2、 将每个浓度的单宁标准溶液分别与所述人工唾液混合并反应， 计算反应后每种 蛋白的蛋白损失率； S1‑3、 对每个单宁标准溶液及其对应的各蛋白的蛋白损失率进行多元线性回归处理， 得到所述线性方程。 8.根据权利要求7 所述一种葡萄酒中单宁含量的测定方法， 其特 征在于， 所述步骤S1 ‑1中， 单宁标准溶液的浓度分别为0.2g/L、 0.5g/L、 1.0g/L、 2.0g/L、 2.5g/ L、 4.0g/L和5.0g/L； 所述步骤S1 ‑2中， 所述人工唾液中的蛋白及其浓度为， 145.7mg/L乳铁蛋白、 19.3mg/L 溶菌酶、 425.8mg/Lα ‑淀粉酶、 10 3.2mg/L牛 血清蛋白、 23 3.6mg/L聚 ‑L‑脯氨酸；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115480003 A 2所述步骤S1 ‑3中得到的所述线性方程为， Y单宁＝0.623X乳铁 蛋 白+3.3409X溶菌酶+3.1954X淀粉酶+ 1.2168X牛血清 蛋 白+1.0526X聚‑L‑脯氨 酸‑0.6648； 其中， X为蛋白损失率， Y为待测酒样中的单宁含 量， 单位为g/L。 9.根据权利要求6所述一种葡萄酒中单宁含量的测定方法， 其特征在于， 所述步骤S4 中， 所述液相色谱法采用的分析参数为： 色谱柱为Zorbax  300SB‑C18色谱柱， 规格为 4.6×250mm， 填料粒径为5 μm； 流动相A相为体积分数0.2％的三氟乙酸水溶液， 流动相B相为含有体积分数0.2％的三 氟乙酸的 甲醇和乙腈的混合溶 液， 其中， 甲醇和乙腈的体积比为70:3 0； 检测时， 所述色谱柱的柱温为40℃， 紫外信号设定为214nm； 所述流动相B相的流速为 0.4mL/mi n； 洗脱方式为梯度洗脱。 10.根据权利要求9所述一种葡萄酒中单宁含量的测定方法， 其特征在于， 所述梯度洗 脱的洗脱程序为： 0～10min， 所述流动相A相的体积百分比为90％， 所述 流动相B相的体积百分比为10％； 10～15min， 所述流动相A相的体积百分比由90％下降至78％， 所述流动相 B相的体积百 分比为由10％上升 至22％； 15～23min， 所述流动相A相的体积百分比为78％， 所述流动相B相的体积百分比为 22％； 23～25min， 所述流动相A相的体积百分比由78％下降至72％， 所述流动相 B相的体积百 分比为由2 2％上升至28％； 25～40min， 所述流动相A相的体积百分比为72％， 所述流动相B相的体积百分比为 28％； 40～40.1min， 所述流动相A相的体积百分比由72％下降至40％， 所述流动相 B相的体积 百分比为由28％上升 至60％； 40.1～50min， 所述流动相A相的体积百分比由40％下降至0， 所述流动相B相的体积百 分比为由6 0％上升至100％； 50～60min， 所述流动相A相的体积百分比为0， 所述 流动相B相的体积百分比为10 0％。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115480003 A 3