(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211023567.1 (22)申请日 2022.08.25 (71)申请人 北京生物制品研究所有限责任公司 地址 100176 北京市大兴区北京经济技 术 开发区博兴二路9号院4 号楼2层205室 (72)发明人 王辉　李世慧　杨柏峰　刘婷　 赵芳圆　付慧　何鹏　 (74)专利代理 机构 北京三友知识产权代理有限 公司 11127 专利代理师 张德斌　姚亮 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/64(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种疫苗中甘油含量的检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种疫苗中甘油含量的检测 方法。 所述疫 苗选自吸附无细胞百(三组分)白破 系列联合疫苗和/或其百日咳中间品， 所述检测 方法包括如下步骤： 预处理疫苗样品， 得到上样 溶液； 采用配备安培检测器的高效阴离子交换色 谱仪对所述上样溶液进行上机检测， 采用外标法 计算得到甘油含量； 其中， 色谱条件包括： 离子色 谱柱为DionexCarboPac  MA‑1离子色谱柱， 柱温 为30‑32℃； 流动相为450 ‑580mM氢氧化钠溶液， 流速为0.3 ‑0.4mL/min， 洗脱方式为等度洗脱； 安 培检测器温度为30℃。 本发明的检测方法具有样 品预处理步骤简单、 测试速度快、 专属性强、 耐用 性好、 精密度和准确度高等优点。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 115420822 A 2022.12.02 CN 115420822 A 1.一种疫苗中甘油含量的检测方法， 所述疫苗选自吸附无细胞百(三组分)白破系列联 合疫苗和/或其百日咳中间 品， 所述检测方法包括如下步骤： 预处理疫苗样品， 得到上样溶液； 采用配备安培检测器的高效阴离子交换色谱仪对所 述上样溶 液进行上机检测， 采用外标法计算得到甘油含量； 其中， 色谱条件包括： 离子色谱柱为DionexCarboPac  MA‑1离子色谱柱， 柱温为30 ‑32 ℃； 流动相为450 ‑580mM氢氧化钠溶液， 流速为0.3 ‑0.4mL/min， 洗脱方式为等度洗脱； 安培 检测器温度为28 ‑32℃。 2.根据权利要求1所述的疫苗中甘油含量的检测方法， 其中， 所述吸附无细胞百(三组 分)白破系列联合疫苗选自吸附无细胞百(三组分)白破联合疫苗、 吸附无细胞百(三组分) 白破灭活脊髓灰质炎联合疫苗、 吸 附无细胞百(三组分)白破灭活脊髓灰质炎b型流感嗜血 杆菌联合疫苗。 3.根据权利要求1所述的疫苗中甘油含量的检测方法， 其中， 所述百 日咳中间品选自脱 毒的百日咳毒素、 脱 毒的丝状血凝素或脱 毒的百日咳黏附素。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的疫苗中甘油含量的检测方法， 其中， 所述色谱条件还 包括： 进样体积为20 ‑25 μL； 信号收集速率 为1Hz。 5.根据权利要求1 ‑3任一项所述的疫苗中甘油含量的检测方法， 其中， 所述外标法包括 进样不同浓度的甘油标准液， 根据甘油标准液的检测结果拟合得到标准物浓度和标准物峰 面积之间的标准曲线方程， 再根据所述标准曲线方程和上样溶液中甘油物质峰面积 检测结 果计算得到甘油浓度。 6.根据权利要求5所述的疫苗中甘油含量的检测方法， 其中， 各甘油标准曲线工作 液的 浓度分布于 0.90‑28.66 μg/mL之间。 7.根据权利要求1 ‑3任一项所述的疫苗中甘油含量的检测方法， 其中， 疫苗的预处理包 括： 离心所述疫苗样品， 并对离心后的上清液进行膜过 滤。 8.根据权利要求7所述的疫苗中甘油含量的检测方法， 其中， 疫苗的离心温度为2 ‑8℃， 离心转速为6 000‑8000rpm， 离心时间为 4‑7min。 9.根据权利要求7 所述的疫苗中甘油含量的检测方法， 其中， 膜过 滤的孔径≤ 0.22 μm。 10.根据权利要求1 ‑3任一项所述的疫苗中甘油含量的检测方法， 其中， 高效阴离子交 换色谱仪还配备有保护柱和在线 脱气机器。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115420822 A 2一种疫苗中甘油含量的检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及疫苗检测技 术领域， 具体涉及一种疫苗中甘油含量的检测方法。 背景技术 [0002]疫苗是预防和控制传染性疾病的有效手段。 吸附无细胞百(三组分)白破(DTacP) 系列联合疫苗是 由多种抗原成分联合配制而成， 在对其进行质量控制研究时， 除了思考联 合疫苗中各组分 间的相互作用外， 还需考虑赋形剂、 防腐剂、 佐剂等辅料成分对联合疫苗活 性成分及检测的影响。 DT acP系列联合疫苗中百日咳毒素(pertussis  toxin， PT)是一种重 要的疫苗抗原， 具有诸多生物学 活性， 如纳克级 未脱毒PT注射 实验动物后， 可引起外周血白 细胞增高、 组胺致敏、 血管活性物质过敏性增强等反应， 故PT需脱毒后方可用于疫苗制备。 为保证疫苗的安全性， 其他抗原如丝状血凝素(filamentous  hemagglutinin， FHA)和百日 咳黏附素(pertactin， PRN)也需进行脱毒处理。 常用的脱毒 方法是使用甲醛、 戊二醛等脱毒 剂处理抗原， 但因这些脱毒剂属蛋白交联剂， 对于目标蛋白的结构影响较大， 甚至会改变抗 原表位， 所以在脱毒工艺中需加入甘油作为抗原保护剂， 使抗原脱毒过程更加温和， 防止抗 原降解和表位损失， 保证脱 毒后抗原的免疫原性。 [0003]甘油属于饱和多羟基化合物， 具有提高蛋白质稳定性的作用， 广泛用于制药、 食品 和日化工业中， 在药剂中常用作润滑剂、 湿润剂、 防腐剂、 溶剂和保护剂等。 离子 色谱法是一 种日趋成熟的仪器分析方法， 现已在环境、 药物和食品等领域有广泛的应用， 用于无机阴离 子、 无机阳离子、 有机酸、 糖醇类、 氨基糖类、 氨基酸、 蛋白质、 糖蛋白等物质的定性和定量分 析。 虽然甘油其毒性较小， 但高浓度 甘油经静脉注射、 肌内注射、 皮下注射、 皮内注射和脊椎 腔注射等途径进入人体后会引起不同程度的副反应， 鉴于此， 对疫苗中的甘油进行定量分 析， 确保其含量在可控范围内， 对保证疫苗 安全有效具有重要意 义。 [0004]目前检测甘油的方法有高碘酸钠氧化滴定法、 密度法、 折光率法、 电化学分析法、 酶法、 紫外光谱法、 高效液相色谱法、 气相色谱法等。 由于甘油的检测波长为200nm， 吸收很 弱， 利用红外 分光光度法检测时形成的甘油峰型较差， 不适合残留含量测定， 常用做鉴别试 验。 2020版 《中 国药典》 采用高碘酸钠滴定 法测定甘油含量， 但 其专属性和准确度较差， 若待 测样品含有邻羟基类成分、 能被高碘酸钠氧化的成分、 能与氢氧化钠溶液反应的成分(氢氧 化铝佐剂)， 均会影响测量结果的准确性； 密度法和折光率法必须保证样品不含其他杂质； 电化学法中电极容易污染； 酶法虽然专 一性好， 但所需试剂价格昂贵； 高效液相和气相色谱 法准确度好， 但样品前处 理步骤繁琐。 [0005]CN107421975A公开了基于定量核磁共振技术(1H ‑NMR和13CNMR)对注射液中的甘 油成分进行含量测定， 虽然该方法有稳定性好、 精密度高等特点， 但是因设备价格昂贵， 对 于大多数生物制品企业来说近几年难以普及； 甘油检测试剂盒(Sigma公司)利用甘油激酶 和甘油磷酸氧化酶的偶联酶测定法， 专一性强， 很少受样品中所含杂质的影响， 操作简单、 灵敏度高、 重现性好， 精密度好且测定速度快， 适用于成分比较复杂的样品中甘油检测， 但 所需试剂价格昂贵， 不利于工业应用和大量样品检测。 联合疫苗中含有多种抗原， 且缓冲液说　明　书 1/8 页 3 CN 115420822 A 3