(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211040987.0 (22)申请日 2022.08.29 (71)申请人 贵州医科 大学 地址 550004 贵州省贵阳市 云岩区北京路4 号 (72)发明人 李月婷　韦迪　李云　黄勇　 巩仔鹏　郑林　刘春花　李勇军　 刘亭　王静　陈思颖　 (74)专利代理 机构 贵州派腾知识产权代理有限 公司 521 14 专利代理师 龙远宁 (51)Int.Cl. C12Q 1/02(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种筛选山慈菇神经保护作用活性成分的 方法 (57)摘要 本发明涉及中药检测技术领域， 具体是一种 筛选山慈菇神经保护活性作用成分的方法。 本申 请先筛选出山慈菇抗神经细胞(PC12细胞)氧化 损伤的活性部位， 然后应用PC12细胞萃取山慈菇 活性部位中具有神经保护作用的活性成分， 收集 细胞时清洗掉未与细胞膜结合或未进入细胞内 的成分， 采用低温反复冻融方式破碎细胞， 使与 PC12细胞特异性结合的活性成分被释放出来， 再 利用QEplus对细胞破碎液中的活性成分进行分 析鉴定， 通过比较山慈菇活性部位细胞破碎液与 阴性对照液， 排除阴性对照液对山慈菇中活性成 分的影响。 最终筛选出天麻素、 DactylorhinC、 DactylorhinE、 DactylorhinA、 Gymnoside Ⅰ、 GymnosideII、 Militarine为山慈菇发挥神经保 护作用的活性成分。 权利要求书2页 说明书13页 附图7页 CN 115305273 A 2022.11.08 CN 115305273 A 1.一种筛选山慈菇神经保护作用活性成分的方法， 其特征在于， 以山慈菇的主要活性 部位为对 象， 以神经细胞为靶细胞萃取模型， 建立靶细胞萃取结合液质联用快速筛选山慈 菇药效成分的方法。 2.根据权利要求1所述的筛选山慈菇神经保护作用活性成分的方法， 其特征在于， 所述 山慈菇， 其基原为云南独蒜兰。 3.根据权利要求1所述的筛选山慈菇神经保护作用活性成分的方法， 其特征在于， 所述 液质联用， 其中液相色谱条件如下： 色谱柱： CORTECS  UPLC T32.1 mm×100mm,1.6μm， 柱温： 40℃， 流速： 0.3mL/min， 流动 相： 0.1％甲酸水溶液(A) ‑0.1％甲酸乙腈溶液(B)， 进样量： 3 μL， 梯度洗脱程序为0～4min， 2％B→5％B； 4～10min， 5％B→9％B； 10～12min， 9％B →15％B； 12～ 15min， 15％B →23％B； 15～25min， 23％B →35％B； 25～35min， 35％B →40％B； 35～40min， 40％B →42％B； 40～ 43min， 42％B →50％B； 43～45min， 50％B →85％B； 45～47min， 85％B →98％B； 47～50min， 98％B→2％B。 4.根据权利要求1所述的筛选山慈菇神经保护作用活性成分的方法， 其特征在于， 所述 液质联用， 其中质谱条件如下： 离子源为电喷雾， 喷雾电压为3500V， 鞘气压力为40arb， 辅助气压力为10arb， 雾化温度 为350℃， 毛细血管温度为320℃， 探头加热器温度为350℃， 扫描模式为全扫描+数据依赖二 级扫描的正负离子交换模式， 扫描范围m/z  100～1500， 一级分辨率为70000， 二级分辨率为 17500。 5.根据权利要求1所述的筛选山慈菇神经保护作用活性成分的方法， 其特征在于， 所述 的以PC12细胞为靶细胞萃取模型， 其具体的细胞萃取实验方法如下： 取对数生长期的PC12细胞， 以8 ×105个/mL的密度接种到6孔板中， 每孔2mL， 培养24h， 将 其分为两组： 空白细胞对照组： 加入2mL完全培养基； 山慈菇活性部位萃取组： 加入2mL山慈 菇活性部位溶液， 浓度为2000μg/mL； 各组给药后于37℃孵育1h， 弃掉上清液， 各组细胞用 PBS轻柔清洗三次， 收集山慈菇活性部位萃 取组第三次清洗液作为阴性对照溶液， 然后向空 白细胞对照组和山慈菇活性部位萃取组中分别加入纯净水2mL， 采用反复冻融法， ‑80℃反 复冻融三次， 破碎细胞， 分别收集各组细胞破碎液， 经涡混5min和超声30min后， 12000rpm离 心10min， 分别吸取上清， 即得空白细胞破碎液和山慈菇活性部位细胞破碎液； 分别将 30mg/ mL的山慈菇活性部位溶液、 阴性对照溶液、 空白细胞破碎液和山慈菇活性部位细胞破碎液 经活化的Oasis  HLB小柱纯化， 纯化方法为： 将所有样品加入Oasis  HLB小柱进行富集， 然后 加入6mL 0.1％甲酸水， 除去样品中盐溶液， 再加12mL甲醇对Oasis  HLB小柱中的样品进行 洗脱， 所得洗脱液经氮气吹干后， 加50％甲醇400 μL复溶， 12000rpm离心10min， 分别取上清 液用于液质联用分析， 鉴定其中成分。 6.根据权利要求1所述的筛选山慈菇神经保护作用活性成分的方法， 其特征在于， 所述 的以PC12细胞为靶细胞萃取模型， 其中PC12细胞 是通过如下 方式进行培 养： 快速取出冻存于 ‑80℃的PC12细胞溶化于37℃的水浴锅中， 将其转移至装有培养液的 培养瓶中， 轻轻混摇， 放入37℃， 5％CO2培养箱中培养， 待细胞生长至75 ‑85％， 即可进行消 化、 传代； 所述培 养液的配制为： 10％胎牛 血清+5％马血清+1％双抗+84％DM EM。 7.根据权利要求1所述的筛选山慈菇神经保护作用活性成分的方法， 其特征在于， 所述权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115305273 A 2液质联用， 其中的对照品溶 液通过如下步骤制备 得到： 分别精密称取天麻素、 Dact ylorhinA、 militarine、 Dactylorhin  E对照品各适量， 置于 5mL容量瓶中， 加甲醇超声溶解后再用甲醇定容， 制得质量浓度均为20.0 μg/mL的单一对照 品溶液， 置于‑20℃冰箱中保存， 备用。 8.根据权利要求1所述的筛选山慈菇神经保护作用活性成分的方法， 其特征在于， 所述 山慈菇的主要活性部位， 是利用D101大孔吸附树脂吸附山慈菇水提物浓缩液， 根据化学成 分的极性特征， 依次用水、 50％乙醇、 95％乙醇梯度洗脱， 得到不同极性大小的洗脱部位， 并 通过体外氧化损伤PC12细胞模型， 以细胞存活率和乳酸脱氢酶泄漏率为评价指标， 最终筛 选得到的活性部位。 9.根据权利要求1所述的筛选山慈菇神经保护作用活性成分的方法， 其特征在于， 所述 山慈菇的主 要活性部位， 是山慈菇5 0％乙醇洗脱部位。 10.根据权利要求9所述的筛选山慈菇神经保护作用活性成分的方法， 其特征在于， 所 述山慈菇50％乙醇洗脱部位， 是称取山慈菇， 水煎并过滤， 收集滤液， 浓缩至浸膏， 采用D101 大孔树脂湿法上样， 依次用水、 50％乙醇洗脱， 收集50％乙醇部分洗脱液， 经减压回收乙醇 后， 水浴蒸干， 即得。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115305273 A 3