(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211052844.1 (22)申请日 2022.08.31 (71)申请人 北京大学第三医院 （北京大 学第三 临床医学院） 地址 100191 北京市海淀区花园北路49号 (72)发明人 熊歆　赵荣生　张现化　张元元　 (74)专利代理 机构 北京天达知识产权代理事务 所有限公司 1 1386 专利代理师 吴娅妮 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/72(2006.01) C07J 41/00(2006.01) (54)发明名称 一种胆汁 酸的检测方法及胆汁 酸衍生物 (57)摘要 本发明涉及一种胆汁酸的检测方法及胆汁 酸衍生物， 该检测方法包括将待测样品与衍生试 剂反应后通过液相色谱和质谱进行分离及检测； 其中， 所述待测样品包括一种或多种胆汁酸， 且 所述一种或多种胆汁酸中的至少部分胆汁酸包 含羧基， 所述衍生试剂包括2 ‑二甲氨基乙胺、 3 ‑ 二甲氨基 ‑1‑丙胺及4‑二甲氨基 ‑1‑丁胺中的一 种或多种。 本发 明一实施方式的胆汁酸的检测方 法， 具有较高的灵敏度和宽的覆盖度， 能够同时 对多种胆汁 酸进行定量分析。 权利要求书2页 说明书18页 附图3页 CN 115420825 A 2022.12.02 CN 115420825 A 1.一种胆汁酸的检测方法， 包括将待测样品与衍生试剂反应后 通过液相色谱和质谱进 行分离及检测； 其中， 所述待测样品包括一种或多种胆汁酸， 且所述一种或多种胆汁酸中的 至少部分胆汁酸包含羧基， 所述衍生试剂包括2 ‑二甲氨基乙胺、 3 ‑二甲氨基 ‑1‑丙胺及4‑二 甲氨基‑1‑丁胺中的一种或多种。 2.根据权利要求1所述的方法， 其中， 所述待测样品中的包含羧基的所述胆汁酸与 所述 衍生试剂发生反应， 所述反应的反应温度为15～3 5℃； 和/或， 所述反应的反应 体系还包括催化剂和偶联剂。 3.根据权利要求2所述的方法， 其中， 所述待测样品包括血清、 尿液、 粪便 中的一种或多 种； 和/或， 所述催化剂包括O ‑(7‑氮杂苯并三唑 ‑1‑基)‑N,N,N’,N’ ‑四甲基脲六氟磷酸酯， 所述偶 联剂包括1 ‑羟基苯并三唑； 和/或， 在所述反应体系中， 所述衍生试剂、 所述催化剂和所述偶联剂的摩尔比为(60～600): (10～100):(10～10 0)。 4.根据权利要求1所述的方法， 包括如下步骤： 提供包含一种或多种同位素胆汁 酸的内标 溶液； 提供包含一种或多种胆汁 酸的具有浓度梯度的多种标准品溶 液； 将所述内标溶液和所述多种标准品溶液混合后 通过液相色谱和质谱进行分离及检测， 根据检测结果及所述内标溶液、 所述标准品溶液中胆汁酸的浓度得到各胆汁酸的定量校正 方程； 提供包含衍生试剂的溶 液； 将所述包 含衍生试剂的溶 液与所述待测样品混合并进行反应， 制得检测样本； 以及 将所述检测样本通过液相色谱和质谱进行分离及检测， 结合检测结果及各胆汁酸的定 量校正方程， 得到各胆汁 酸的检测结果； 其中， 所述标准品溶液中的胆汁酸的种类与所述待测样品中的胆汁酸的种类相同， 所 述内标溶液中的胆汁 酸为所述待测样品中的至少部分胆汁 酸的同位素 标记物。 5.根据权利要求1所述的方法， 其中， 在所述液相色谱中， 采用反相C18色谱柱， 柱温为 30～45℃， 流速为0.2～0.4mL/min， 流动相A为甲酸铵和醋酸的混合水溶液， 流动相B为乙腈 溶液。 6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法， 其中， 所述多种胆汁酸包括能够与所述衍 生试剂发生反应的含羧基的胆汁 酸和不能与所述 衍生试剂发生反应的其 他胆汁酸； 在所述质谱检测中， 采用电喷雾电离正离子检测模式对所述含羧基的胆汁酸进行扫 描， 采用电喷雾电离负离 子检测模式对所述 其他胆汁酸进行扫描。 7.根据权利 要求6所述的方法， 其中， 在所述质谱检测中， 离子源温度为500～600℃， 雾 化气压为30～50psi， 辅助气压为40～60psi， 气帘气的压力为25～45psi， 喷雾电压为4000 ～5000V或‑4000～‑5000V。 8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法， 其中， 所述一种或多种胆汁酸包括游离羟 基化胆汁酸、 游离酮 基化胆汁酸、 硫酸/葡萄糖醛酸结合型胆汁酸、 甘氨结合型胆汁酸、 甘氨 硫酸双结合型胆汁 酸、 牛磺结合型胆汁 酸中的一种或多种。 9.根据权利要求8所述的方法， 其中， 所述游离羟基化胆汁酸包括： 3β,5α,6β ‑羟基‑胆权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115420825 A 2烷酸、 3α,7α,12β ‑羟基‑5β‑胆烷酸、 3α,7β,12α ‑羟基‑5β‑胆烷酸、 ω ‑鼠胆酸、 α ‑鼠胆酸、 β ‑ 鼠胆酸、 3β ‑胆酸、 3β,7β ‑羟基‑5β‑胆烷酸、 3α,6β ‑羟基‑5β‑胆烷酸、 3β,6α ‑羟基‑5β‑胆烷 酸、 猪胆酸、 熊去氧胆酸、 猪去氧胆酸、 3β,7α ‑羟基‑5β‑胆烷酸、 胆酸、 3β,12β ‑羟基‑5β‑胆烷 酸、 3α,12β ‑羟基‑5β‑胆烷酸、 3β,12α ‑羟基‑5β‑胆烷酸、 鹅去氧胆酸、 去氧胆酸、 3β ‑羟基‑5 α‑胆烷酸、 3β‑羟基‑5β‑胆烷酸、 7α,12α ‑羟基‑5β‑胆烷酸、 石胆酸、 12α ‑羟基‑5β‑胆烷酸； 所述游离酮基化胆汁酸包括： 3α,7β ‑羟基‑12‑酮基‑5β‑胆烷酸、 脱氢胆酸、 3α ‑羟基‑7, 12‑酮基‑5β‑胆烷酸、 3α,6α ‑羟基‑7‑酮基‑5β‑胆烷酸、 3α,12α ‑羟基‑7‑酮基‑5β‑胆烷酸、 3 α,7β‑羟基‑6‑酮基‑5α‑胆烷酸、 3α ‑羟基‑6‑酮基‑5α‑胆烷酸、 3α ‑羟基‑7‑酮基‑5β‑胆烷酸、 3α‑羟基‑6,7‑酮基‑5β‑胆烷酸、 3,7‑酮基‑5β‑胆烷酸、 3α‑羟基‑12‑酮基‑5β‑胆烷酸； 所述硫酸/葡萄糖醛酸结合型胆汁酸包括： 熊去氧胆酸 ‑3‑葡糖苷、 胆酸 ‑3‑葡糖苷、 熊 去氧胆酸‑3‑硫酸、 胆酸 ‑3‑硫酸、 胆酸 ‑7‑硫酸、 甘氨鹅脱氧胆酸 ‑3‑葡糖苷、 甘氨去 氧胆酸‑ 3‑葡糖苷、 鹅去氧胆酸 ‑3‑葡糖苷、 去氧胆酸 ‑3‑葡糖苷、 鹅去氧胆酸 ‑3‑硫酸、 去氧胆酸 ‑3‑ 硫酸、 石胆酸 ‑3‑葡糖苷、 石胆酸 ‑3‑硫酸； 所述甘氨结合型胆汁酸包括： 甘氨脱氢胆酸、 3β ‑甘氨胆酸、 甘氨 ‑β‑鼠胆酸、 甘氨猪胆 酸、 甘氨熊去氧胆酸、 甘氨猪去氧胆酸、 甘氨胆酸、 12 ‑酮基‑甘氨石胆酸、 甘氨鹅去氧胆酸、 甘氨去氧胆酸、 甘 氨石胆酸； 所述甘氨硫酸双结合型胆汁酸包括： 甘氨熊去氧胆酸 ‑3‑硫酸、 甘氨胆酸 ‑3‑硫酸、 甘氨 鹅去氧胆酸 ‑3‑硫酸、 甘氨去氧胆酸 ‑3‑硫酸、 甘氨石胆酸 ‑3‑硫酸； 所述牛磺结合型胆汁酸包括： 牛磺熊去氧胆酸 ‑3‑硫酸、 牛磺胆酸 ‑3‑葡糖苷、 牛磺胆 酸‑3‑硫酸、 牛磺 ‑ω‑鼠胆酸、 牛磺 ‑α‑鼠胆酸、 牛磺 ‑β‑鼠胆酸、 牛磺鹅去氧胆酸 ‑3‑葡糖苷、 牛磺鹅去氧胆酸 ‑3‑硫酸、 牛磺猪胆酸、 牛磺去氧胆酸 ‑3‑硫酸、 牛磺熊去氧胆酸、 牛磺猪去 氧胆酸、 牛磺胆酸、 牛磺石胆酸 ‑3‑硫酸、 12‑酮基牛磺石胆酸、 牛磺鹅去 氧胆酸、 牛磺去 氧胆 酸、 牛磺石胆酸。 10.一种胆汁酸衍生物， 由胆汁酸与衍生试剂反应制得， 所述衍生试剂包括2 ‑二甲氨基 乙胺、 3‑二甲氨基 ‑1‑丙胺及4‑二甲氨基 ‑1‑丁胺中的一种或多种， 所述胆汁 酸包含羧基。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115420825 A 3