(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210984085.6 (22)申请日 2022.08.17 (71)申请人 中国农业科 学院茶叶研究所 地址 310008 浙江省杭州市西湖区梅灵南 路9号 (72)发明人 朱荫　严寒　林智　戴伟东　郭丽　 吕海鹏　张悦　谭俊峰　彭群华　 施江　周梦雪　 (74)专利代理 机构 杭州浙科专利事务所(普通 合伙) 33213 专利代理师 沈渊琪 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/04(2006.01) G01N 30/06(2006.01)G01N 30/72(2006.01) G01N 30/88(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的 检测方法 (57)摘要 一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的 检测方法， 属于茶叶检测分析技术领域。 该方法 包括： 配制芳樟醇樱草糖苷混合消旋体标准品溶 液； 对芳樟 醇樱草糖苷标准品溶液进行手性超高 效液相色谱 ‑质谱联用分析， 确定芳樟醇樱草糖 苷对映异构体的定性参数， 绘制芳樟醇樱草糖苷 对映异构体标准工作曲线； 采用同样的条件对茶 汤中的芳樟醇樱草糖苷对映异构体进行手性 UPLC‑QQQ‑MS分析； 参照标准品中的定性参数及 标准工作曲线， 计算出茶叶芳樟 醇樱草糖苷对映 异构体的含量。 采用本发明提供的方法可实现对 茶叶芳樟醇樱草糖苷对映异构体的精确定性定 量检测。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 115326968 A 2022.11.11 CN 115326968 A 1.一种茶叶中芳 樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法， 其特 征在于包括以下步骤： 1)配制芳 樟醇樱草糖苷混合消旋体标准品溶 液； 2)对芳樟醇樱草糖苷标准品溶液进行手性超高效液相色谱 ‑质谱联用UPLC ‑QQQ‑MS分 析， 确定芳樟醇樱草糖苷对映异构体的定性参数， 绘制芳樟醇樱草糖苷对映异构体标准工 作曲线； 3)提取茶汤中芳樟醇樱草糖苷对映异构体， 采用步骤2)的条件对茶汤中的芳樟醇樱草 糖苷对映异构体进行手性UPLC ‑QQQ‑MS分析； 4)参照标准品中的定性参数及标准工作曲线， 计算出茶叶芳樟醇樱草糖苷对映异构体 的含量。 2.如权利要求1所述的一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法， 其特征在 于所述步骤1)中芳 樟醇樱草糖苷混合消旋体标准品溶 液浓度范围为1.20～ 26.00mg/L。 3.如权利要求1所述的一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法， 其特征在 于所述步骤2)中以芳樟醇樱草糖苷对映异构 体标准品浓度为横坐标、 芳樟醇樱草糖苷对映 异构体定量离 子峰峰面积为纵坐标， 绘制芳 樟醇樱草糖苷对映异构体的标准工作曲线。 4.如权利要求1所述的一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法， 其特征在 于所述步骤2)中手性UPLC ‑QQQ‑MS中色谱条件具体为： 色谱柱： Asec  CYCLOBONDR I 2000HP‑RSP； 流动相： 流动相A为0.1％v/v甲酸水 溶液， 流动相B为乙腈； 梯度洗脱条件： 0.00 ‑3.00min， 10 ‑25％B； 3.00 ‑9.00min， 25 ‑40％B； 9.00 ‑11.00min， 40‑90％B； 11.00‑12.00min， 90％B； 12.0 0‑12.10min， 90‑10％B； 12.10 ‑16.00min， 10％B。 5.如权利要求1所述的一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法， 其特征在 于所述步骤2)中手性UPLC ‑QQQ‑MS中质谱条件具体为： 离子化模式为正离子模式ESI+， 扫描模式为多反应监测， 毛细管电压为3.0kV， 脱溶剂 气N2温度为400℃， 碰撞气体是氩气， 锥孔电压45V， 锥孔气 流速50L/hr， 去溶剂气流速550L/ hr， 驻留时间为0.10 0s， 碰撞能为3 0V。 6.如权利要求1所述的一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法， 其特征在 于所述步骤3)中提取茶汤中芳 樟醇樱草糖苷对映异构体具体为： 称取茶粉样500.0mg ±0.5mg于离心管中， 加入5mL沸纯净水， 摇匀后在70℃水浴浸提30 分钟后， 用离心机低温离心10分钟； 取 上清液经0.22 μm微孔滤膜过 滤于样品瓶中备用。 7.如权利要求4所述的一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异构体的检测方法， 其特征在 于所述色谱柱为Sup elco Asec CYCLOBONDR  I 2000HP‑RSP， 规格为15cm ×4.6mm×5 μm； 所 述色谱条件中， 进样量 为2 μL， 流速为0.6mL/mi n， 柱温35℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115326968 A 2一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷 对映异构体的检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于茶叶检测分析技术领域， 具体涉及一种茶叶中芳樟醇樱草糖苷对映异 构体的检测方法。 背景技术 [0002]芳樟醇是一种重要的萜类化合物， 广泛存在于自然界中， 在茶叶、 水果、 植物、 咖 啡、 香料等食品或生命体中均存在， 对食品或植物的风味品质形成起着 举足轻重的作用。 茶 叶中的芳樟醇主要以游离态和糖苷键合态两种形式存在， 游离态的芳樟醇具有清新馥郁的 迷人花香， 气味阈值低(4 ‑10ng/mL)， 挥发性强， 可被人体嗅觉系统直接感知， 对茶叶香气品 质的形成起着直接的促进作用。 糖苷键合态的芳樟醇不具有挥发性， 无色无味， 在茶鲜叶和 成品茶中均有所分布， 可在酶、 热、 光照、 辐射、 化学法等方式下分解， 从而释放出芳樟醇配 基， 同样对茶叶香气品质的形成起着 举足轻重的作用。 不仅如此， 糖苷键合态 芳樟醇也被认 为是重要的潜香物质， 由于其具有较强的耐高温能力， 在特定条件下能够释放香气成分， 可 以达到缓释香气的效果， 因此在香精香料领域也有着广阔的应用前景。 目前在茶叶中能检 测到的键合态芳樟醇以芳樟醇樱草糖苷及芳樟醇葡萄糖苷最为多 见， 其中芳樟醇樱草糖苷 的含量远高于芳 樟醇葡萄糖苷。 [0003]无论是糖苷键合态或游离态芳樟醇， 由于分子结构中含有不对称碳原子， 它们均 为手性物质， 具有旋光性， 形成了空间结构上两两镜面对称的对映异构 体。 对映异构体间具 有相同的平面结构、 物理性质(如熔点， 沸点， 溶解度， 折射率， 酸性， 密度等)、 热力学性质 (如自由能， 焓、 熵 等)和化学性质， 因此很长一段时间被人们所忽视。 直到有研究表明， 芳樟 醇对映异构体在风味特征、 生理活性等方面可能存在极大的差异， 且不同来源(产地、 品种、 加工工艺)的食品或植物间的芳樟醇对映异构体分布特征存在显著差异， 才引起了研究者 们的一些关注。 然而， 正是由于手性化合物的对映异构体在理化性质上具有高度相似性， 通 常仅在手性环境(手性固定相、 流动相等)中方可实现对映异构体分离及检测， 且不同手性 环境与对映异构体的作用力也不尽相同， 需要针对化合物的结构特性进行广谱性筛选。 然 而市面上流通的手性色谱柱型号众多， 所含固定相繁多复杂， 高达上百种， 且售价也较为昂 贵(平均1万元/根)， 往 往给手性 化合物的色谱分离带来较大的经济负担和技 术挑战。 [0004]目前， 游离态的芳樟醇对映异构体已被成功分离， 并在食品领域被广泛研究。 相反 地， 糖苷键合态芳樟醇的对映异构体在茶叶乃至生命科学领域的研究均罕有相关研究报 道， 究其原因， 一方面糖苷的提取难度较大， 往往需要复杂的提取分离过程(溶剂提取、 柱分 离、 液液萃取等)； 另一方面， 由于化学结构中缺少共轭基团， 芳樟醇樱草糖苷的紫外吸收 弱， 在常规液相色谱中无法出峰， 因此在常规检测分析上已存在较大难度， 而 更深层次的对 映异构体分离则是需要更多的技 术含量， 因此 更具有挑战性。 [0005]早期的研究往往利用糖苷的酸解或酶解反应特性， 通过制造酸性环境、 外源添加 茶鲜叶粗 酶(丙酮粉)等方式使其释放出苷元， 继而通过GC ‑MS手段测定苷元结构， 利用葡萄 糖氧化酶试剂盒测定糖基结构， 从而获得糖苷化合物的整体结构信息及含量情况。 该方法说　明　书 1/6 页 3 CN 115326968 A 3