(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210633437.3 (22)申请日 2022.06.07 (71)申请人 华中科技大 学同济医学院附属协和 医院 地址 430000 湖北省武汉市解 放大道127 7 号 (72)发明人 董念国　李飞　蔡子文　徐力　 乔韡华　史嘉玮　王月　陈思　 (74)专利代理 机构 武汉信合红谷知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 42264 专利代理师 解波 (51)Int.Cl. C12M 3/06(2006.01) C12M 1/00(2006.01)C12N 5/077(2010.01) C12N 5/071(2010.01) (54)发明名称 一种3D心脏瓣膜类器官培育器及其使用方 法 (57)摘要 本发明公开了一种3D心脏瓣膜类器官培育 器及其使用方法， 包括正面培育盒和反面培育 盒， 所述正面培育盒包括第一盒体和第一盒盖， 所述第一盒盖上设有相互连通的第一加液槽和 第一培养槽， 所述第一培养槽的底部设有微孔半 透膜， 所述反面培育盒包括第二盒体和第二盒 盖， 所述第二盒盖上设有相互连通的第二加液槽 和第二培养槽， 所述第二培养槽的底部设有镂空 托板， 所述第一盒体和所述第二 盒体内均设有培 养液腔。 本发明用于3D心脏瓣膜类器官的培育, 可以在培育过程中保持内皮细胞层和间质细胞 层均与培养液进行充分的营养交换， 保证培育的 三层心脏瓣膜类器官结构完整的同时， 避免发生 细胞凋亡， 极大提高心脏瓣膜类器官的培育成功 率。 权利要求书1页 说明书5页 附图6页 CN 114774278 A 2022.07.22 CN 114774278 A 1.一种3D心脏瓣膜类器官培育器， 其特征在于： 包括正面培育盒和反面培育盒， 所述正 面培育盒包括第一盒体和 第一盒盖， 所述第一盒盖上设有相互连通的第一加液槽和第一培 养槽， 所述第一培养槽的底部 设有微孔半透膜， 所述反面培育盒包括第二盒体和 第二盒盖， 所述第二盒盖上设有相互连通的第二加液槽和 第二培养槽， 所述第二培养槽的底部 设有镂 空托板， 所述第一盒体和所述第二盒体内均设有培养液腔， 所述第一加液槽和所述第二加 液槽的侧壁上均设有出 液孔。 2.根据权利要求1所述的一种3D心脏瓣膜类器官培育器， 其特征在于： 所述第 一培养槽 和所述第一加液槽之间通过螺纹可拆卸地连接 。 3.根据权利要求1所述的一种3D心脏瓣膜类器官培育器， 其特征在于： 所述第 一培养槽 的底部设有卡槽和与所述卡槽配合的固定环， 所述微孔半透膜的边缘通过所述固定环压紧 固定在所述第一培 养槽内。 4.根据权利要求1所述的一种3D心脏瓣膜类器官培育器， 其特征在于： 所述第 一培养槽 和所述第二培 养槽的侧壁上均设有半透 板。 5.根据权利要求4所述的一种3D心脏瓣膜类器官培育器， 其特征在于： 所述半透板由镂 空的硬质支撑网和填充在所述硬质支撑网内的高分子半透填料组成。 6.根据权利要求1所述的一种3D心脏瓣膜类器官培育器， 其特征在于： 所述镂 空托板为 十字形或环形。 7.根据权利要求1所述的一种3D心脏瓣膜类器官培育器， 其特征在于： 所述微孔半透膜 和所述镂空托板的材 料均采用生物相容 性好的聚氨酯或聚乙丙交酯。 8.根据权利要求1 ‑7任一项所述的一种3D心脏瓣膜类器官培育器的使用方法， 其特征 在于， 包括以下步骤： S1、 将所述第 一盒盖打开， 向所述正面培育盒上的所述第 一盒体内加入培养液， 再将所 述第一盒盖放置在所述第一盒体上， 将间质细胞与凝胶混合后的物质通过所述第一加液槽 加入所述第一培养槽内， 间质细胞与凝胶的混合物与所述微孔半透膜接触， 然后再向所述 第一加液槽内加入培养液， 使培养液 的深度超出所述出液孔， 与所述第一盒体内的培养液 连通混合， 间质细胞在所述第一培养槽的底部通过所述微孔半透膜与培养液产生营养物质 交换， 待4天后间质细胞生长 完成形成间质细胞层； S2、 取出所述第一盒盖， 倒出所述第一培养槽内的培养液， 通过所述第 一加液槽向所述 第一培养槽内加入内皮细胞， 使内皮细胞处于间质细胞层上方， 再将所述第一盒盖放置到 所述第一盒体上， 通过所述第一培养槽向内皮细胞上方加入培养液， 培养4 天后形成完整的 内皮细胞层， 然后再次倒出培养液， 将所述第一培养槽内具有单层内皮细胞层与间质细胞 层的结构从所述正面培养盒中倒出， 将所述第一培养槽倒立向下对准所述反面培育盒， 撕 下所述微孔半透膜， 将有内皮细胞层的一面朝下放入所述反面培育盒内的所述第二培养槽 内， 使内皮细胞层与所述镂空托板 接触； S3、 通过所述第二加液槽向所述反面培育盒内加入培养液， 使培养液充满所述第二盒 体和所述第二培养槽， 向所述第二培养槽内再加入内皮细胞进行培养， 使新加入的内皮细 胞处于间质细胞层上方， 由于所述第二培养槽的底部为镂空结构， 内皮细胞层可以与所述 第二盒体内的培养液进行气体交换与营养物质交换， 不会凋亡， 再培育4天后， 所述反面培 育盒中新加入的内皮细胞层也 生长完好， 这样就形成了类似天然瓣膜的三层 细胞结构。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774278 A 2一种3D心脏瓣膜类器 官培育器及其使用方 法 技术领域： [0001]本发明涉及生物实验器械技术领域， 具体涉及一种3D心脏瓣膜类器官培育器及其 使用方法。 背景技术： [0002]类器官是近年来新兴的疾病研究模型， 国外已有大脑类器官、 视杯状类器官、 心肌 类器官、 肠类器官、 肝类器官等， 而心脏瓣膜类器官在心脏疾病的实验研究中存在大量的应 用需求。 如专利申请号为RO201900736的专利提供了一种制备瓣膜小叶的三维生物印迹模 型的方法， 通过制备分离自人瓣膜的瓣膜间质细胞(VIC)悬浮液的混合物， 在2 ×106个细 胞/ml的密度下， 用预先由猪凝胶制备的凝胶， 甲基丙烯 酸酐， 抗生素， 海藻酸钠溶液和光引 发剂， 将混合物装入生物打印机的注射器中， 生物打印3D构建体， 然后进行水凝胶光聚合， 将交联的构建体转移到通常用于细胞培养的培养基上24小时， 在37℃的温度下， 体外接种 分离自人瓣膜的瓣膜内皮细胞(VEC)， 在8 ×104个细胞/cm2的密度下， 将它们保持在37℃的 细胞培养箱中， 在48小时内， 5％CO2在3D构建体表面形成VEC的汇合层并形成VIC的内部细 胞网络， 然后根据形成钙化中心的能力评估3D模型。 专利申请号为ES13811696的专利也提 供了一种当细胞和组织层在三维中生长成心脏瓣膜时对它们进行成形和固定的模具和工 艺。 但是由于心脏瓣膜表面两层薄薄的内皮细胞层与中间的大量间质细胞层组成的三明治 结构， 现有的心脏瓣膜类器官培育装置在进行培育时， 心脏瓣膜类器官朝下 的一面内皮细 胞由于与培养皿底面接触， 会因为缺少氧气与营养物质而发生凋亡， 难以形成天然瓣膜上 下两层内皮细胞中间是间质细胞的三明治结构， 极易 导致培育失败。 发明内容： [0003](一)解决的技 术问题 [0004]针对现有技术的不足， 本发明提供一种3D心脏瓣膜类器官培育器及其使用方法， 用于3D心脏瓣膜类器官的培育， 解决现有技术在进 行心脏瓣膜类器官培育时朝下的一面内 皮细胞与培养皿底面接触， 因为缺少氧气与营养物质而发生凋亡， 难以形成正常的心脏瓣 膜结构， 极易 导致培育失败的问题。 [0005](二)技术方案 [0006]为解决上述技术问题， 本 发明提供如下技术方案： 一种3D心脏瓣膜类器官培育器， 包括正面培育盒和反面培育盒， 所述正面培育盒包括第一盒体和第一盒盖， 所述第一盒盖 上设有相互连通的第一加液槽和第一培养槽， 所述第一培养槽的底部设有微孔半透膜， 所 述反面培育盒包括第二盒体和 第二盒盖， 所述第二盒盖上设有相互连通的第二加液槽和 第 二培养槽， 所述第二培养槽的底部设有镂空托板， 所述第一盒体和所述第二盒体内均设有 培养液腔， 所述第一加液槽和所述第二加液槽的侧壁上均设有出 液孔。 [0007]所述第一盒盖可以放置在所述第一盒体上， 所述第二盒盖同样可以放置在所述第 二盒体上， 所述第一培养槽和所述第一加液槽处于所述第一盒体内的所述培养液腔 内， 所说　明　书 1/5 页 3 CN 114774278 A 3