(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210609931.6 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 深圳大学 地址 518060 广东省深圳市南 山区南海大 道3688号 (72)发明人 陈雯雯　陈永欣　王纪东　 (74)专利代理 机构 北京品源专利代理有限公司 11332 专利代理师 潘登 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12M 1/34(2006.01) C12M 1/00(2006.01) (54)发明名称 一种检测 KRAS、 NRAS、 BRAF和PIK3CA基因突 变的引物探 针组合及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种检测KRAS、 NRAS、 BRAF和 PIK3CA基因突变的引物探针组合及其应用。 所述 引物探针组合包括检测KRAS、 NRAS、 BRAF和 PIK3CA基因突变的引物和探针。 本发明设计检测 KRAS、 NRAS、 BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针 组合， 利用数字PCR对肿瘤 中KRAS、 NRAS、 BRAF和 PIK3CA基因的14种热点突变进行定性检测， 具备 良好特异性和灵敏度， 且操作简便、 成本低。 权利要求书2页 说明书9页 序列表5页 附图5页 CN 114934105 A 2022.08.23 CN 114934105 A 1.一种检测 KRAS、 NRAS、 BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针组合， 其特征在于， 所述引 物探针组合包括检测KRAS、 NRAS、 BRAF和PIK3 CA基因的引物和探针； 所述KRAS基因的引物包括3对引物， 核酸序列包括SEQ  ID NO.1～SEQ  ID NO.6所示的 序列； 所述KRAS基因的野生型探针的核酸序列包括SEQ  ID NO.7～SEQ  ID NO.9所示的序列； 所述KRAS基因的参 考探针的核酸序列包括SEQ  ID NO.10～SEQ  ID NO.11所示的序列； 所述NRAS基因的引物包括2对引物， 核酸序列包括SEQ  ID NO.12～SEQ  ID NO.15所示 的序列； 所述NRAS基因的野生型探针的核酸序列包括SEQ  ID NO.16和SEQ  ID NO.17所示的序 列； 所述NRAS基因的参 考探针的核酸序列包括SEQ  ID NO.18和SEQ  ID NO.19所示的序列； 所述BRAF基因的引物包括1对引物， 核酸序列包括SEQ  ID NO.20和SEQ  ID NO.21所示 的序列； 所述BRAF基因的野生型探针的核酸序列包括SEQ  ID NO.22； 所述BRAF基因的参 考探针的核酸序列包括SEQ  ID NO.23； 所述PIK3CA基因的引物包括1对引物， 核酸序列包括SEQ  ID NO.24和SEQ  ID NO.25所 示的序列； 所述PIK3 CA基因的野生型探针的核酸序列包括SEQ  ID NO.26； 所述PIK3 CA基因的参 考探针的核酸序列包括SEQ  ID NO.27。 2.根据权利要求1所述的检测 KRAS、 NRAS、 BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针组合， 其 特征在于， 所述探针的5 ’端标记有荧 光基团， 3 ’端标记有淬灭基团； 优选地， 所述 荧光基团包括FAM、 VIC、 TET、 JOE、 H EX、 TAMRA、 ROX、 C Y5或Texas Red； 优选地， 所述淬灭基团包括MGB、 TAMRA、 DABC YL、 BHQ‑1、 BHQ‑2、 BHQ‑3或Eclipse。 3.权利要求1或2所述的检测 KRAS、 NRAS、 BRAF和PIK3CA基因突变的引物探针组合在制 备检测KRAS、 NRAS、 BRAF和PIK3 CA基因的产品中的应用。 4.一种检测 KRAS、 NRAS、 BRAF和PIK3CA基因突变的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包 括权利要求1或2所述的检测KRAS、 NRAS、 BRAF和PIK3 CA基因突变的引物探针组合。 5.根据权利要求4所述的检测 KRAS、 NRAS、 BRAF和PIK3CA基因突变的试剂盒， 其特征在 于， 所述试剂盒还 包括PCR反应液； 优选地， 所述PCR反应液包括DNA聚合酶、 Mg2+、 dNTPs和水。 6.一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测KRAS、 NRAS、 BRAF和PIK3CA基因突变的方 法， 其特征在于， 所述方法包括： 以待测样本中的基因组为模板， 利用权利要求1或2所述的检测KRAS、 NRAS、 BRAF和 PIK3CA基因突变的引物探针组合进行数字PCR， 进行荧光信号检测， 根据数字PCR结果进行 结果判读。 7.根据权利要求6所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测KRAS、 NRAS、 BRAF和 PIK3CA基因突变的方法， 其特 征在于， 所述数字PCR的反应条件为： 93～98℃预变性10mi n； 93～96℃、 25～3 5sec， 55～65℃、 25～3 5sec， 共45～5 5个循环。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114934105 A 28.根据权利要求6所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测KRAS、 NRAS、 BRAF和 PIK3CA基因突变的方法， 其特征在于， 所述结果判读包括对微滴进行分类， 判读是否产生突 变。 9.一种检测 KRAS、 NRAS、 BRAF和PIK3CA基因突变的装置， 其特征在于， 所述装置包括检 测单元和分析 单元； 所述检测单 元用于执 行包括： 以待测样本中的基因组为模板， 利用权利要求1或2所述的检测KRAS、 NRAS、 BRAF和 PIK3CA基因突变的引物探针组合进行 数字PCR， 进行微 滴计数及荧 光信号检测； 所述分析 单元用于执 行包括： 根据数字PCR结果进行 结果判读。 10.根据权利要求9所述的检测KRAS、 NRAS、 BRAF和PIK3CA基因突变的装置， 其特征在 于， 所述数字PCR的反应条件为： 93～98℃预变性8～12mi n； 93～96℃、 25～3 5sec， 55～65℃、 25～3 5sec， 共45～5 5个循环； 优选地， 所述结果判读包括对微 滴进行分类， 判读是否产生 突变。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114934105 A 3