(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210674737.6 (22)申请日 2022.06.15 (71)申请人 清华-伯克利深圳学院筹备办公室 地址 518000 广东省深圳市南 山区桃源街 道学苑大道1001号南山智园 (72)发明人 雷正扬　刑容艺　何倩　秦培武　 张立琨　翟士尧　刘畅悦　钟晓蕴　 连丽津　伊嘉格尔　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 罗新 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12M 1/34(2006.01) C12M 1/00(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种检测传染性脾肾坏死病毒的引物组、 试 剂盒及其方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种检测传染性脾肾坏死病 毒的引物组、 试剂盒及其方法和应用。 本发明的 检测传染性脾肾坏死病毒的引物组， 包括： 上游 引物F1和下游引物R； 其中， 所述上游引物F 1的核 苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述下游引物R选 自R1、 R2、 R3中的任 一种， 该引物组能够特异性识 别传染性脾肾坏死病毒的ORF70L基因序列。 此 外， 本发明的检测传染性脾肾坏死病毒的方法具 备速度快、 特异性强、 能够现场检测、 不需要大型 设备、 检测成本低的优点， 可以在采样的现场进 行快速检测， 手机拍摄成像结果传 送至云端处理 后在手机生成检测结果。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图2页 CN 115261513 A 2022.11.01 CN 115261513 A 1.一种检测传染性脾肾坏死病毒的引物组， 包括： 上游引物F1和下游引物R； 所述上游引物F1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述下游引物R选自R 1、 R2、 R3中的任一种； 其中R1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示， R2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示， R3的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示。 2.一种检测传染性脾肾坏死病毒的试剂盒， 包 含权利要求1所述的引物组和crRNA； 所述crRNA包含锚定序列和向导序列， 所述锚定序列与Cas蛋白特异性识别， 所述向导 序列与所述传染性脾肾坏死病毒的靶序列特异性识别； 所述crRNA的锚定序列如SEQ  ID NO.10所示； 所述crRNA的向导序列如SEQ  ID NO.11所示。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包含cas蛋白和信号报告 探针。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述cas蛋白为Cas12a； 所述信号报告探针包 含核酸序列， 所述核酸序列如SEQ  ID NO.8所示； 所述核酸序列的一端标记荧 光报告基团， 另一端标记淬灭报告基团。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述荧光报告基团选自FAM、 HEX、 TET、 TAMRA中的任一种； 所述淬灭报告基团选自BHQ1、 BHQ2、 BHQ3中的任一种。 6.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包含E ‑Mix Reaction   Buffer、 RPA缓冲液、 MgCl2、 Cas蛋白解缓冲液和传染性脾肾坏死病毒标准品。 7.一种非诊断目的 的传染性脾肾坏死病毒检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤S1： 提取待检样品的DNA； 步骤S2： 采用权利要求2 ‑6任一项所述的试剂盒对步骤S1所述的DNA依次进行RPA扩增 反应和Cas蛋白酶检测反应， 读取检测信号， 即得。 8.根据权利要求7 所述的非诊断目的 的传染性脾肾坏死病毒检测方法， 其特 征在于， 所述RPA扩增反应的条件为3 6～38℃下反应25～3 0min； 所述Cas蛋白酶检测反应的条件为3 6～38℃下反应25～3 0min。 9.一种检测系统， 其特征在于， 包含权利要求2 ‑6任一项所述的试剂盒和检测用仪器， 所述检测用仪器包括具有拍摄功能的手机 。 10.如权利要求1所述的引物组或如权利要求2 ‑6任一项所述的试剂 盒在制备传染性脾 肾坏死病毒检测试剂中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261513 A 2一种检测传染性脾肾坏死病毒 的引物组、 试剂盒及其方 法和 应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术领域， 尤其是涉及一种检测传染性脾肾坏 死病毒的引 物组、 试剂盒及其方法和应用。 背景技术 [0002]传染性脾肾坏死病毒(In fection spleen and kidney necrosis  virus， ISKNV) 属虹彩病毒科、 肿大细胞病毒属(Megaloc ytivirus)， 是导致水生动物暴发性死亡的重要病 原， 给水生动物养殖业造成严重的经济损失， 因此， 高效、 准确地检测方法是提前预防传染 性脾肾坏死病毒传染的重要手段。 [0003]相关技术中， 针对病毒的不同生物分子， 目前主要分为三类检测方法。 第一类是针 对病毒自身的检测， 即病毒分离提取法。 通过获取样本， 分离样本内的病毒， 通过观察病毒 对寄生细胞的致病作用来诊断感染及感染程度。 该方法不但需要在严苛的生物安全条件下 由专业人员实施操作， 而且耗时很长， 往往需要 数天才能获得结果， 不利于病毒的筛查和疫 情的控制。 第二类是针对病毒蛋白的检测。 蛋白衣壳是病毒的重要组成部 分， 其将遗传物质 (RNA或DNA)包裹在内起到保护作用， 并对进入寄生细胞有重要影 响。 因此， 样 本中病毒蛋白 成分的检出同样预示着病毒的感染。 另外， 被病毒感染后， 往往会出现抗原抗体反应， 血液 样本内检测出相应病毒的抗原或抗体， 同样能够证实病毒的感染。 因此， 免疫化学检测方 法， 如酶联免疫吸附测定(enzyme ‑linked immunosorbent  assay， ELISA)及荧光抗体检测 方法(Fluorescent  antibody  testing)也成为病毒检测的方法之一。 虽然目前此类方法用 于病毒检测较为普遍， 但其灵敏度较低， 病毒蛋白或相应的抗原抗体需要达到一定程度才 能被检测出来。 而病毒感染早期， 抗原抗体含量往往达不到检测水平， 因此易出现假阴性， 妨碍疫情的控制。 第三类是针对病毒核酸的检测， 主要包括基因组测序和核酸扩增法。 基因 组测序是病毒类型定性的金标准。 根据基因组的同源性， 可以通过遗传溯源将病毒归类， 如 SARS‑CoV‑2的归类即是通过此方法。 虽然准确性高， 但此类方法耗时长， 需要昂贵的测序仪 器以及专业的技术人员进行实验操作以及数据分析。 因此， 无法满足高通量筛查以及现场 检测的要求。 核酸扩增法是最普遍用的病毒检测方法， 主要包括法有聚合酶链式反应 (Polymerase  chain reaction,PCR)， 重组酶聚合酶扩增( Recombinase  polymerase   amplification， RPA)以及环介导等温扩增(loop ‑mediated  isothermal  amplification， LAMP)技术等。 该类方法都是通过针对病毒核酸序列， 设计相应引物在相应的反应条件 下实 现病毒核酸的扩增。 其中P CR技术需要PCR仪调节反应温度来实现扩增， 而RPA和LAMP在恒温 条件下即可完成核酸扩增， 无需复杂的仪器和反应条件， 但核酸扩增过程中易出现引物的 错配以及 扩增产物的失真， 从而导致假阳性的产生。 因此， 这些方法对于高通量现场检测筛 查感染病毒的患者有较多的局限性。 [0004]总体而言， 这些方法在准确性、 时效性及灵敏度上有所欠缺， 且需要昂贵的检测仪 器、 专业的技术人员和大量的样本， 或者存在检测所需时间较长、 检测速度较慢、 反应条件说　明　书 1/9 页 3 CN 115261513 A 3