(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211160560.4 (22)申请日 2022.09.22 (71)申请人 烟台大学 地址 264000 山东省烟台市莱山区清泉路 30号 (72)发明人 付元磊　李燕　徐梅霞　李暖暖　 荣荣　王琳　孙考祥　 (74)专利代理 机构 烟台上禾知识产权代理事务 所(普通合伙) 37234 专利代理师 邓绮霞 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/30(2006.01) G01N 30/32(2006.01)G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种生物样本中铂类前 药的定量测定方法 (57)摘要 本发明涉及一种生物样本中铂类前药的定 量测定方法， 可用于铂类前药的药代和毒代动力 学研究。 该方法首先制备标准曲线， 然后测定生 物样本中的铂类前药浓度， 随后通过标准曲线计 算出待测样品中铂类前药的含量。 本发明中涉及 的检测方法是基于高效液相色谱(HPLC)与电感 耦合等离子体质谱(ICP/MS)联用技术， 通过HPLC 分离定性铂类前药， 再经ICP/MS测定生物样本中 铂类前药含量。 本发明具灵敏度高、 重现性好等 特点， 可解决聚合物偶联铂类前药分子量大， 分 子量不唯一造成的药代动力学研究难题。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 115406998 A 2022.11.29 CN 115406998 A 1.一种生物样本中铂类前药的定量测定方法， 其特征在于， 采用高效液相色谱(HPLC) 与电感耦合 等离子体质谱(ICP/ MS)联用技 术， 测定步骤 包括： a.将获得的生物样本进行提取； b.建立药物测定标准曲线； c.使用HPLC ‑ICP/MS测定待测样品， 通过步骤b所得标准曲线计算出待测样本中铂类前 药的药物浓度。 2.根据权利要求1所述的测定方法， 其特征在于， HPLC可将不同价态的铂类药物进行分 离， ICP/MS能够高灵敏的测定铂含量， HPLC ‑ICP/MS联用可以应用于生物样 本中不同价态铂 类药物的分离与检测。 3.根据权利要求1所述的测定方法， 其特征在于， 生物样本包括血浆、 血清、 细胞、 组织 匀浆液、 尿液和粪便 。 4.根据权利要求1所述的测定方法， 其特征在于， 步骤a生物样本处理方法包括甲醇蛋 白沉淀法、 乙腈蛋白沉淀法、 柱纯化法。 5.根据权利要求4所述的测定方法， 其特征在于， 步骤a生物样本处理方法采用甲醇蛋 白沉淀法， 在生物样本中加入5 ‑10倍量的甲醇， 涡旋混匀后， 高速离心提取上清液， 置于氮 吹仪中挥干， 加入甲醇复溶后用于铂类药物含量测定 。 6.根据权利要求1所述的测定方法， 其特征在于， 采用高效液相色谱与电感耦合等离子 体质谱联用技术， 其中高效液相色谱的流动相采用甲醇A ‑含酸的水溶液B体系进行等度洗 脱， 所述的酸为乙酸， 乙酸的百分含量为1％ ‑0.05％， 液相条件的色谱柱 为反向C18柱， 柱温 20℃‑40℃， 流动相比例为A:B＝70:3 0‑95:5。 7.根据权利要求1所述的测定方法， 其特征在于， 采用高效液相色谱与电感耦合等离子 体质谱联用技术， 其中ICP/MS测定条件为： 氩气为电离气， 氦气为载气， 雾化器流速为1L/ min， 冷却器流速为10 ‑14L/min， 辅助气0.8L/min， 采样深度为3 ‑8mm， 等离子体功率为12 00‑ 1800W， 根据铂原子分子量进行测定 。 8.根据权利要求1所述的测定方法， 其特征在于， 所述的铂类前药包括 聚乙二醇修饰的 奥沙利铂、 顺铂、 卡铂、 洛铂。 9.根据权利要求8所述的测定方法， 其特征在于， 所述的铂类前药为聚乙二醇修饰的奥 沙利铂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115406998 A 2一种生物样本中铂类前 药的定量测定方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 一种生物样本中铂类前药的定量测定方法， 具体涉及一种生物样本中 聚合物偶联铂类前 药的定量测定方法。 背景技术 [0002]20世纪60年代铂类药物开发上市， 包括顺铂、 卡铂、 奥沙利铂等， 铂类药物抗癌机 制独特， 抗癌谱广， 已经成为目前临床上最广使用的化疗药物之一。 尽管疗效显著， 铂类药 物靶向性差， 易引起严重的胃肠道反应、 神经和骨髓毒性， 有强烈的剂量限制性毒性， 严重 限制其临床使用效果和给药剂量。 近年来,基于纳米技术的药物递送策略和聚合物偶联技 术为奥沙利铂化疗提供了新的解决途径。 如中国科学院上海药物所申报的CN106074379B， 奥沙利铂经过氧化后， 铂由高生物活性二价态变成低生物活性的四价态， 经聚乙二醇偶联 后能够自组装成胶束， 可以改善药物体内代谢行为， 降低了铂类药物的全身、 骨髓和免疫毒 性， 抗肿瘤活性 提升。 [0003]药物的体内代谢行为对于新药的研发有重要的指导意义， 但 现有测定方法对铂类 药物的体内代谢研究有一定的局限性。 铂类药物经聚合物修饰后， 药物的分子量呈现正态 分布的形式， 常规的HPLC ‑MS/MS挑战大， 缺乏对铂类药物活性 成分的有效跟踪。 传统的铂类 药物常采用ICP /MS测定生物样 本中总铂的方式研究体内药代动力学行为， 但聚合物 修饰的 铂类前药测总铂的方法不能有效区分二价铂和四价铂在体内药动行为， 限制了聚合物修饰 铂类前药的临床转化。 高效液相色谱法是检测铂类药物常用的检测方法， 但是采用HPLC ‑UV 方法检测铂类前 药， 检测限在1 μg/mL的范围， 不 适合检测生物样本中铂类前 药的含量。 发明内容 [0004]本发明针对上述现有技术存在的不足， 提供一种生物样本中铂类前药的定量测定 方法， 操作简单、 结果可靠、 特异 性号、 灵敏度高、 分析时间短、 线性关系良好。 所述方法采用 HPLC‑ICP/MS联用技术， 其中HPLC可使不同价态的铂类代谢物得到很好的分离， ICP/MS方法 可对不同价态铂类药物含量进行测定 。 [0005]在联用方法 中， 液相色谱流动相选择甲醇， 相比乙腈及其他有机溶剂， 甲醇在测定 铂类代谢物时色谱 峰理论塔板数更高， 具有更优的色谱行为。 在水相中添加乙酸可以使色 谱峰峰宽更窄， 适 合检测。 [0006]具体技术方案如下： [0007]一种生物样本中铂类前药的定量测定方法， 采用高效液相色谱(HPLC)与电感耦合 等离子体质谱(ICP/ MS)联用技 术， 测定步骤 包括： [0008]a.将获得的生物样本进行提取； [0009]b.建立药物测定标准曲线； [0010]c.使用HPLC ‑ICP/MS测定待测样品， 通过步骤b所得标准曲线计算出待测样本中铂 类前药的药物浓度。说　明　书 1/4 页 3 CN 115406998 A 3