(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211127805.3 (22)申请日 2022.09.16 (71)申请人 复旦大学附属中山医院 地址 200032 上海市徐汇区枫林路180号 (72)发明人 杨文静　郭玮　王蓓丽　潘柏申　 (74)专利代理 机构 上海点威知识产权代理有限 公司 31326 专利代理师 杜焱 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/04(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 30/86(2006.01) C12Q 1/6886(2018.01) (54)发明名称 一种肝细胞癌预后诊断试剂盒 (57)摘要 本发明一种肝细胞癌预后诊断试剂盒， 包括 用于检测N ‑乙酰‑2‑氨基己二酸、 丙酮酸、 N ‑硬脂 酰鞘氨醇(d18:1/18:0)、 棕榈酰二氢鞘磷脂 (d18:0/16:0)、 1 ‑硬脂酰‑2‑油酰‑GPC(18:0/18: 1)、 棕榈酰鞘磷脂(d18:1/16:0)浓度所需的内标 标准品。 将HCC患者组织外泌体中的N ‑乙酰‑2‑氨 基己二酸、 丙酮酸、 N ‑硬脂酰鞘氨醇(d18:1/18: 0)、 棕榈酰二氢鞘磷脂(d18:0/16:0)、 1 ‑硬脂酰‑ 2‑油酰‑GPC(18:0/18:1)、 棕榈酰鞘磷脂(d18:1/ 16:0)浓度带入回归方程中， 当数值超过6.73E+ 05时， 认为患者预后不佳。 本发明通过对获取的 组织外泌体进行代谢组学分析， 筛选出一组能够 用于诊断HCC患者预后的高灵敏、 高特异性的外 泌体代谢物组合。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 115541742 A 2022.12.30 CN 115541742 A 1.一种肝细胞癌预后诊断试剂盒， 其特征在于， 包括用于检测N ‑乙酰‑2‑氨基己二酸、 丙酮酸、 N ‑硬脂酰鞘氨醇(d18: 1/18:0)、 棕榈酰二氢鞘磷脂(d18:0/16:0)、 1 ‑硬脂酰‑2‑油 酰‑GPC(18:0/18:1)、 棕榈酰鞘磷脂(d18 :1/16:0)浓度所需的内标 标准品。 2.根据权利要求1所述的一种肝细胞癌预后诊断试剂 盒， 其特征在于， 采用超高效液相 色谱‑串联质谱技 术， 基于内标物浓度， 对肝细胞癌组织 来源的外泌体样本进行检测。 3.根据权利要求2所述的一种肝细胞癌预后诊断试剂 盒， 其特征在于， 采用超高效液相 色谱‑串联质谱技术的条件为： 流动相A为体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液， 洗脱相B 为体积百分比浓度为0.1％的甲酸乙腈溶液； 柱温为50℃； 流动相流速为0.35mL/min； 质谱 条件： 正离子模式检测离子源温度为500℃， 喷雾电压为5.0kV； 负 离子模式检测的离子源温 度为450℃， 喷雾电压为 ‑4.5kV。 4.根据权利要求1所述的一种肝细胞癌预后诊断试剂 盒， 其特征在于， 将肝细胞癌患 者 组织外泌体中的N ‑乙酰‑2‑氨基己二酸、 丙酮酸、 N ‑硬脂酰鞘氨醇(d18:1/18:0)、 棕榈酰二 氢鞘磷脂(d18:0/16:0)、 1 ‑硬脂酰‑2‑油酰‑GPC(18:0/18:1)、 棕榈酰鞘磷脂(d18:1/16:0) 浓度带入回归方程中， 所述的回归方程为： Y＝1.418*N ‑乙酰‑2‑氨基己二酸+29.512*丙酮 酸+28.217*N ‑硬脂酰鞘氨醇(d18:1/18:0)+28.917*棕榈酰二氢鞘磷脂(d18:0/16:0)+ 13.907*1‑硬脂酰‑2‑油酰‑GPC(18:0/18:1)+0.783*棕榈酰鞘磷脂(d18:1/16:0) ‑30.930)， 计算Y值， 当数值超过6.73 E+05时， 认为患者预后不佳。 5.N‑乙酰‑2‑氨基己二酸、 丙酮酸、 N ‑硬脂酰鞘氨醇(d18:1/18:0)、 棕榈酰二氢鞘磷脂 (d18:0/16:0)、 1 ‑硬脂酰‑2‑油酰‑GPC(18:0/18:1)、 棕榈酰鞘磷脂(d18:1/16:0)作为联和 诊断的代谢 标记物在制备肝细胞癌预后诊断生物标记 物中的用途。 6.根据权利 要求5所述的用途， 其特征在于， 将HCC患者组织外泌体 中的N‑乙酰‑2‑氨基 己二酸、 丙酮酸、 N ‑硬脂酰鞘氨醇(d18: 1/18:0)、 棕榈酰二氢鞘磷脂(d18:0/16:0)、 1 ‑硬脂 酰‑2‑油酰‑GPC(18:0/18: 1)、 棕榈酰鞘磷脂(d18: 1/16:0)浓度带入回归方程中， 所述的回 归方程为： Y＝1.418*N ‑乙酰‑2‑氨基己二酸+29.512*丙酮酸+28.217*N ‑硬脂酰鞘氨醇 (d18:1/18:0)+28.917*棕榈酰二氢鞘磷脂(d18:0/16:0)+13.907*1 ‑硬脂酰‑2‑油酰‑GPC (18:0/18:1)+0.783*棕榈酰鞘磷脂(d18:1/16:0) ‑30.930)， 计算Y值， 当数值超过6.73E+05 时， 认为患者预后不佳。 7.一种预后诊断HCC组织外泌体的代谢物组合， 其特征在于， 包括N ‑乙酰‑2‑氨基己二 酸、 丙酮酸、 N ‑硬脂酰鞘氨醇(d18:1/18:0)、 棕榈酰二氢鞘磷脂(d18:0/16:0)、 1 ‑硬脂酰‑2‑ 油酰‑GPC(18:0/18:1)、 棕榈酰鞘磷脂(d18 :1/16:0)。 8.权利要求7 所述的代谢物组合在制备肝细胞癌预后诊断试剂盒中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115541742 A 2一种肝细胞癌预后诊断试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于生物医学检测领域， 涉及一种诊断试剂盒， 具体来说是一种肝细胞癌 预后诊断试剂盒。 背景技术 [0002]外泌体已成为生命科学的研究热点， 近年来对其形成、 释放及其发挥的生物学功 能等方面的研究取得了重大进展。 研究表明， 外泌体是一种 直径在30 ‑100nm的双层膜性囊 泡， 在肿瘤发生、 进展、 侵袭、 转移、 耐药及免疫逃逸等生物学过程中有重要作用。 其可通过 携带蛋白质 、 脂质、 RNA、 DNA等多种 生物学活性成分， 并由多种细胞通过胞吐方式分泌至微 环境中参与细胞间通讯交流。 [0003]目前， 对外泌体的研究方式主要集中于两方面： 1)检测患者疾病状态下， 不同类型 体液中高表达的外泌体内容物； 2)通过分析细胞上清液外泌体， 进 行系列功能学实验， 证明 外泌体内容物在疾病类型中的生物学作用。 然而， 上述两种 方法对于反 映肝肿瘤内部微环 境的情况仍存在较大 的缺陷。 如细胞系培养方法会受到细胞传代的影响， 由细胞系分泌的 外泌体会随着传代次数的增加， 活性及分子表型均发生变异。 重要的是， 细胞系由于缺乏肿 瘤微环境的复杂性， 无法反 映肿瘤组织内部的异质性， 很多在细胞系中发挥生物学作用的 活性物质， 回归到肿瘤组织中却无明显作用。 研究发现， 细胞经过多次培养传代后， 可能不 再代表肿瘤， 而从这些细胞系中分离出 的外泌体可能会受到其长期细胞培养的影响， 改变 EVs的特性。 患者体液来源的外泌体尽管在 疾病的诊断、 预后评估方面显示出较大的应用潜 力， 但由于体液内部细胞种类的复杂性， 无法解决外泌体来源问题。 重要的是， 体液来源的 外泌体不一定具有疾病 特异性， 而组织外泌体研究能弥补上述方法的不足。 研究者通过对 脑组织来源的外泌体进行RNA分析， 发现其能更好的反映全脑组织的表达情况。 重要的是， 组织来源的外泌体具有EVs经典标志物， 包含更多的组织器官和细胞信息来源。 因此， 肿瘤 组织来源外泌体相对其它方法分离的外泌体， 更能反 映肿瘤复杂微环境的真实性、 更丰富 的信息来源及疾病特异性。 [0004]肿瘤的发生发展与癌细胞的代谢重编程密切相关。 肿瘤患者机体产生的异常代谢 物是反映基因组及蛋白质组变化的终点信号。 通过代谢组学分析可以预测肿瘤细胞早期表 型的改变， 寻找出具有 特异性诊断价值的生物标志物。 研究表明， 在肿瘤细胞发生表型改变 之前， 通过检测体内小分子代谢物的变化， 就能提早做出诊断， 是肿瘤早期诊断的可靠生物 标志物。 近年来， 关于外泌体作为标志物的专利 及文章多集中在内容物蛋白， 脂质及 核酸检 测上， 鲜有研究关注外泌体代谢物发生的变化及其在肿瘤诊断中的应用价值， 尤其是组织 外泌体来源代谢物在疾病诊断方面的价 值。 [0005]HCC(肝细胞癌)是肝脏原发恶性肿瘤的最主要类型， 占比85％ ‑90％， 属于中国第 五大恶性肿瘤， 死亡率位居所有癌症类型中第三， 严重威胁着患者的生活质量与生命健康。 目前， 根治性切除术仍是唯一可能治愈肝癌的方法， 但即使接受手术治疗， 仍然有50 ‑70％ 患者在术后5年内发生转移/复发， 成为极度困扰临床的肝癌治疗难题。 因此， 寻找能有效评说　明　书 1/5 页 3 CN 115541742 A 3