(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211237129.5 (22)申请日 2022.10.11 (71)申请人 海南康植肽生物科技有限公司 地址 572025 海南省三 亚市崖州区崖州湾 科技城南繁众创中心 9层905-28 申请人 海南大学三亚研究院 (72)发明人 刘森　赵艺博　吴松　宋旗　 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/30(2006.01) G01N 30/32(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 30/74(2006.01) (54)发明名称 一种表面活性素的检测方法 (57)摘要 本公开提供了一种表 面活性素的检测方法， 所述方法包括： 获取含有表面活性素的待测样 品； 制备表面活性素标准样品， 并对标准样品进 行HPLC‑MS测定， 得到标准曲线； 对所述待测样品 进行HPLC ‑MS测定， 根据所述标准曲线确定所述 待测样品中表面活性素的含 量； 其中， HPLC ‑MS的 液相条件为： 流动相为乙腈和三氟乙酸； 质谱条 件为： 流动相为甲醇和三氟乙酸。 其中， 待测样品 为表面活性素发酵液、 浓缩表面活性素样品、 表 面活性素酸沉淀过程中的上清液中的任意一种。 通过本发明的方法， 能够对表面活性素进行定 性、 定量检测， 具有灵敏度高、 快速、 准确的优势。 权利要求书1页 说明书6页 附图10页 CN 115308342 A 2022.11.08 CN 115308342 A 1.一种表面活性素的检测方法， 其特 征在于， 所述方法包括： 获取含有表面活性素的待测样品； 制备表面活性素 标准样品， 并对标准样品进行HPLC ‑MS测定， 得到标准曲线； 对所述待测样品进行HPLC ‑MS测定， 根据所述标准曲线确定所述待测样品中表面活性 素的含量； 其中， HPLC ‑MS的液相条件为： 流动相为乙腈和三氟乙酸； 质谱条件为： 流动相为甲醇和 三氟乙酸。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述液相条件中， 所述三氟乙酸的浓度为 0.05‑0.1%， 乙腈与三氟乙酸的体积比为20% ‑100%： 80%‑0%， 且乙腈的含量先增 加后降低。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， HPLC开始时， 流动相中 乙腈与0.05%三氟乙 酸的体积比为20%： 80%； 50min时， 流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为60%： 40%； 55min时， 流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为80%： 20%； 85min时， 流动相中乙腈为 100%； 90min时， 流动相中乙腈与0.0 5%三氟乙酸的体积比为20%： 80%。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述液相条件中， 检测波长为210nm， 色谱 柱为C18柱， 流速为0.8 ‑1.2mL/mi n。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的方法， 其特征在于， 所述质谱条件中， 所述三氟乙酸 的浓度为0.05 ‑0.1%， 甲醇与三氟乙酸的体积比为20% ‑100%： 80% ‑0%， 且甲醇的含量先增加 后降低。 6.根据权利 要求5所述的方法， 其特征在于， 质谱开始时， 流动相中甲醇与0.05%三氟乙 酸的体积比为20%： 80%； 3min 时， 流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为60%： 40%； 5min 时， 流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为90%： 10%； 15.01min时， 流动相中甲醇为 100%； 35.01min时， 流动相中甲醇与0.0 5%三氟乙酸的体积比为20%： 80%。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 质谱 的一级质谱条件为： 分辨率70000， 自 动增益控制目标3e6， 最大循环次数20 0ms， 扫描范围10 00‑1600m/z。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述待测样品为表面活性素发酵液、 浓缩 表面活性素样品、 表面活性素酸 沉淀过程中的上清液中的任意 一种。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 由表面活性素发酵液制备浓缩表面活性素 样品， 包括： 将表面活性素发酵 液离心， 取 上层清液并调节pH 至2.0‑4.0， 过夜沉淀表面活性素； 继续离心分离， 取出沉淀并用1mol/L  Tris‑HCl溶解， 并用正丁醇萃取多次， 萃取液经 过冷冻干燥得到的固体使用甲醇溶解， 再用有机相过 滤器过滤得到浓缩表面活性素样品。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115308342 A 2一种表面活性素的检测方 法 技术领域 [0001]本公开涉及化学检测的技 术领域， 尤其涉及一种表面活性素的检测方法。 背景技术 [0002]表面活性素 （Surfact in） 于1968年首次在枯草芽胞杆菌(Bacillussubt ilis)的培 养液中发现， 由一个疏水 的脂肪烃链与亲水 的氨基酸环构成的环状脂肽组成。 表面活性素 表现出各种生理活性， 包括作为纤维蛋白凝固抑制剂和细胞裂解物。 表面活性素具有抗病 毒、 抗肿瘤作用， 还 可抗细菌、 抗真菌、 抗支原体、 抗炎， 抗菌谱较广， 同时具有不易产生耐药 性、 可被动物消化酶降解、 无残留等优点， 均显示 其应用于医药业的潜力。 [0003]目前对于表面活性素的检测， 尤其是定性和定量方法上， 均 存在灵敏度低的缺陷， 因此， 需要一种灵敏度高的检测方法。 发明内容 [0004]本公开提供了一种表面活性素的检测方法， 以至少解决现有技术中存在的以上技 术问题。 [0005]根据本公开的第一方面， 提供了一种表面活性素的检测方法， 所述方法包括： 获取含有表面活性素的待测样品； 制备表面活性素 标准样品， 并对标准样品进行HPLC ‑MS测定， 得到标准曲线； 对所述待测样品进行HPLC ‑MS测定， 根据所述标准曲线确定所述待测样品中表面 活性素的含量； 其中， HPLC‑MS的液相条件为： 流动相为乙腈和三氟乙酸的混合物； 质谱条件为： 流 动相为甲醇和三氟乙酸的混合物。 [0006]在一可实施方式中， 所述液相条件中， 所述三氟乙酸的浓度为0.05 ‑0.1%， 乙腈与 三氟乙酸的体积比为20% ‑100%： 80%‑0%， 且乙腈的含量先增 加后降低。 [0007]在一可实施方式中， HP LC开始时， 流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为20%： 80%； 50min时， 流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为60%： 40%； 55min时， 流动相中乙腈 与0.05%三氟乙酸的体积比为80%： 20%； 85min时， 流动相中乙腈为100%； 90min时， 流动相中 乙腈与0.0 5%三氟乙酸的体积比为20%： 80%。 [0008]在一可实施方式中， 所述液相条件中， 检测波长为210nm， 色谱柱为C18柱， 流速为 0.8‑1.2mL/mi n。 [0009]在一可实施方式中， 所述质谱条件中， 所述三氟乙酸的浓度为0.05 ‑0.1%， 甲醇与 三氟乙酸的体积比为20% ‑100%： 80%‑0%， 且甲醇的含量先增 加后降低。 [0010]在一可实施方式中， 质谱开始时， 流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为20%： 80%； 3min时， 流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为60%： 40%； 5min时， 流动相中甲醇与 0.05%三氟乙酸的体积比为90%： 10%； 15.01min时， 流动相中甲醇为100%； 35.01min 时， 流动 相中甲醇与0.0 5%三氟乙酸的体积比为20%： 80%。说　明　书 1/6 页 3 CN 115308342 A 3