(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211119646.2 (22)申请日 2022.09.15 (71)申请人 山东省食品药品检验研究院 地址 250101 山东省济南市高新 技术开发 区新泺大街2749号 (72)发明人 李洁　刘艳明　王艳丽　田其燕　 李海霞　陈倩倩　鞠香　李芳芳　 梁秀清　胡梅　 (74)专利代理 机构 济南泉城专利商标事务所 37218 专利代理师 王翠翠 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/04(2006.01) G01N 30/06(2006.01)G01N 30/72(2006.01) G01N 30/88(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种非衍生化-气相色谱-串联质谱法快速 测定植物油中5种植物甾醇的方法 (57)摘要 本发明公开了一种非衍生化 ‑气相色谱 ‑串 联质谱法测定植物油中5种植物甾醇的方法， 基 于脂肪酶对脂肪的酶解作用， 构建了一种室温皂 化的前处理方式， 将植物油中结合态的甾醇酯高 效游离出来， 利用 气相色谱 ‑串联质谱仪建立了 植物油中的菜籽甾醇、 β ‑谷甾醇、 芸薹甾醇、 豆 甾醇、 环阿屯醇5种甾醇的检测方法。 在弱极性色 谱柱HP‑5MS上5种甾醇色谱行为良好； 方法的加 标回收率在84.7%~101.6%之间， 相对标准偏差为 1.4%~4.1%， 5种甾醇定量限均为10.0  mg/kg。 相 较于标准方法中前处理操作繁琐、 皂化条件苛 刻、 萃取时分层困难、 需要 衍生的特点， 本研究开 发的方法更加快速简便， 便于植物油中甾醇的快 速测定。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 115308341 A 2022.11.08 CN 115308341 A 1.一种非衍生化 ‑气相色谱 ‑串联质谱法快速测定植物油中5种植物甾醇的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： （1） 样品的前处理： 准确称取0.10  g植物油样品于50  mL离心管中， 加入pH=8.0 ‑10.0的 磷酸盐缓冲溶液5  mL和0.05g脂肪酶， 涡旋混匀2min， 于25 ‑45℃恒温水浴振荡仪中进行酶 解， 5‑20 min后将酶解液取出； 待酶解液冷却后加入加入1.5  g碳酸钾， 再依次加入10  ml无 水乙醇和10  mL水， 涡旋混匀皂化2 ‑25 min； 加入10  mL正己烷进行萃取5  min， 6000  r/min 离心2 min， 移取上层清液于另一个50  mL离心管， 再加 入10 mL正己烷萃取一次； 合并萃取 液， 混匀； （2） 配制标准溶液： 分别准确称取10.0  mg菜籽甾醇、 β ‑谷甾醇、 芸薹甾醇、 豆甾醇、 环阿 屯醇标准品于10.0  ml容量瓶中， 正己烷定容至刻度， 得到质量浓度为1.00  mg/ml的单标标 准溶液； 量取适量的各甾醇单标标准溶液至同一容量瓶中， 配制成质量浓度为0.1  mg/ml的 混合标准溶液； 分别吸取混合标准溶液0.1、 0.2、 0.5、 1.0、 2.0、 5.0  mL于10 mL容量瓶中， 配 成质量浓度为1.0、 2.0、 5.0、 10.0、 20.0、 5 0.0 mg/L的标准工作溶 液； （3） 气相色谱 ‑质谱检测。 2.根据权利要求1所述的一种非衍生化 ‑气相色谱 ‑串联质谱法快速测定植物油中5种 植物甾醇的方法， 其特征在于， 样品的前处理的优化条件为： 准确称取0.10  g植物油样品于 50 mL离心管中， 加入pH=9.0的磷酸盐缓冲溶液5  mL和0.05g脂肪酶， 涡旋混匀2min； 于3 7℃ ±2℃恒温水浴振荡仪中进行酶解， 20  min后将酶解液取出； 待酶解液冷却后加入加入1.5   g碳酸钾， 再依次加入10  ml无水乙醇和10  mL水， 涡旋混匀皂化10  min； 加入10  mL正己烷进 行萃取5 min， 6000  r/min离心2  min， 移取上层 清液于另一个50  mL离心管， 再加入10  mL正 己烷萃取一次； 合并萃取 液， 混匀。 3.根据权利要求1所述的一种非衍生化 ‑气相色谱 ‑串联质谱法快速测定植物油中5种 植物甾醇的方法， 其特征在于， 色谱柱： 型号为HP ‑5MS， 尺寸为： 30  m×0.25 mm×0.25 μm； 进 样口温度： 250℃； 离子源温度： 200℃； 辅助加热温度： 280℃； 进样方式： 不分流进样， 进样 量： 1 μl； 程序升温： 150℃保持1  min， 然后以10℃/min升至280℃， 保持12  min， 再以20℃/ min升至300℃， 保持8  min； 电子轰击电离源， 多反应监测 （MRM） 模式进行采集。 4.根据权利要求1所述的一种非衍生化 ‑气相色谱 ‑串联质谱法快速测定植物油中5种 植物甾醇的方法， 其特征在于， 5种植物甾醇为菜籽甾醇、 芸薹甾醇、 豆甾醇、 β ‑谷甾醇和环 阿屯醇。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115308341 A 2一种非衍生化 ‑气相色谱 ‑串联质谱法 快速测定植物油中5种 植物甾醇的方 法 技术领域 [0001]本发明属于食品分析技术领域， 具体涉及一种非衍生化 ‑气相色谱 ‑串联质谱法快 速测定植物油中5种植物甾醇的方法。 背景技术 [0002]植物甾醇是一种重要的天然活性物质， 是一类以甾核为基础骨架的化合物， 其结 构式见图1， 其中含量较高的有β ‑谷甾醇、 豆甾醇、 菜籽甾醇和芸薹甾醇4种。 植物甾醇具有 防止冠心动脉粥样 硬化、 抗炎、 保护皮肤及增强免疫力等作用， 能够调节人体对胆固醇的吸 收， 已被列入功能食品范畴。 人体不能自行合成植物甾醇， 只能从食物中获取， 植物油是膳 食甾醇的来源之一。 据研究报道， 甾醇处于热、 光、 金属离子等环境中， 容易产生氧化反应， 形成甾醇氧化物。 在植物油的加工生产 环节 （脱臭脱酸） 及植物油的精炼均容易引起甾醇的 氧化和分解， 从而导致甾醇的损失。 因此， 发展一种 快速、 准确测定植物油中甾醇含量的检 测技术， 对于评价和监控植物油品质具有重要意 义。 [0003]测定植物甾醇的仪器方法主要有气相色谱法、 液相色谱法、 色谱 ‑质谱联用技术、 薄层色谱法及多维气相色谱 ‑飞行时间质谱法。 植物甾醇主要以游离态甾醇和结合态甾醇 酯两种形式存在， 准确测定甾醇的含量需要测定两种 形态的甾醇总量。 目前报道的游离态 甾醇的前处理技术主要是固相萃取技术， 结合态甾醇的检测通常采用氢氧化钾 ‑乙醇溶液 对样品进行皂化水解， 将甾醇释放出来后， 利用衍生化试剂N,O ‑双三甲基硅基三氟乙酰胺 或N  ‑甲基‑N  ‑三甲基硅烷七氟丁酰胺衍生化后进行检测。 现行甾醇的检测标准GB/T   23225‑2010 《动植物油脂  甾醇组成和甾醇总量的测定  气相色谱法》 和NY/T  3111‑2017 《植 物油中甾醇含量的测定  气相色谱 ‑质谱法》 是基于上述前处理技术建立的。 由于皂化条件 苛刻 （强碱溶液、 水浴温度高、 皂化时间长） ， 萃取时操作繁琐， 水洗时容易乳化， 分层困难， 导致目标物的绝对回收率低， 结果的重现性差， 需要加入内标进行 校正。 发明内容 [0004]为了解决以上背景技术的不足， 本发明的目的在于克服技术不足， 提供一种 非衍 生化‑气相色谱 ‑串联质谱法快速测定植物油中5种植物甾醇的方法， 该方法开发了一种快 速酶解、 室温皂化的前处理技术， 无需衍生， 建立了用气相色谱 ‑三重四极杆串联质谱法测 定植物油中β ‑谷甾醇、 豆甾醇、 菜籽甾醇和芸薹甾醇、 环阿屯醇5种甾醇的方法， 外标法定 量。 方法前处理简便、 快捷， 灵敏度高， 重现性好， 回收率和稳定性均能满足检测要求， 适用 于批量样品中甾醇的检测。 [0005]为实现上述目的， 本发明采用下述 技术方案： 5种植物甾醇为菜籽甾醇、 芸薹甾醇、 豆甾醇、 β ‑谷甾醇和环阿屯醇。 [0006]一种非衍 生化‑气相色谱 ‑串联质谱法快速测定植物油中5种植物甾醇的方法， 包括以下步骤：说　明　书 1/7 页 3 CN 115308341 A 3