(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211107521.8 (22)申请日 2022.09.13 (71)申请人 贵州医科 大学 地址 550000 贵州省贵阳市花溪区花溪大 学城栋青路2号 (72)发明人 郑林　黄勇　夏涛　周祖英　 迟明艳　巩仔鹏　李月婷　潘洁　 (74)专利代理 机构 昆明润勤同创知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 53205 专利代理师 付石健 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/72(2006.01)G01N 30/88(2006.01) G01N 30/86(2006.01) A01K 67/02(2006.01) (54)发明名称 基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关 节炎代谢组学研究方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于气质联用技术的黑 骨藤抗类风湿性关节炎代谢 组学研究方法， 包括 以下步骤： (1)溶液配制； (2)大鼠类风湿关节炎 模型的建立； (3)黑骨藤提取物的制备； (4)大鼠 血浆样品的收集； (5)血浆样品前处理； (6)GC ‑MS 分析； (7)GC ‑MS血浆代谢组矩阵数据模式识别分 析； (8)差异代谢物的鉴定及代谢通路分析。 本发 明的优点为： 黑骨藤提取物具有明显的抗类风湿 关节炎(RA)的作用； 整合GC ‑MS及相关分析初步 筛选出与黑骨藤治疗RA相关的内源性代谢成分 及代谢途径。 提示黑骨藤可能是通过对相关代谢 通路进行调节， 从而达到抗类风湿关节炎的作 用。 权利要求书2页 说明书19页 附图13页 CN 115290797 A 2022.11.04 CN 115290797 A 1.一种基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法， 其特征在 于： 包括以下步骤： (1)溶液配制； (2)大鼠类风湿关节炎模型的建立； (3)黑骨藤提取物的制备； (4)大鼠血浆样品的收集； (5)血浆样品前处 理； (6)GC‑MS分析； (7)GC‑MS血浆代谢组矩阵数据模式识别分析； (8)差异代谢物的鉴定及代谢通路分析。 2.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究 方法， 其特征在于： 所述步骤(1)中溶液配制为甲氧胺吡啶溶液配制和MSTFA溶液配制， 所述 甲氧胺吡啶溶液的配制方法为称取甲氧胺盐酸盐150mg于10mL的容量瓶中， 无水吡啶定容 至刻度， 配制成浓度为15mg/mL的溶液； 所述MSTFA溶液的配制方法为吸取MSTFA990μL加 TMCS 10 μL， 混匀即得。 3.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究 方法， 其特征在于： 所述步骤(2)中模型的建立包括以下步骤： 各组大鼠测定其足容积及踝 关节周长作为基础值， 于每只大鼠右后足足垫皮内注 射0.1mL CFA试剂， 正常组注 射相应的 生理盐水， 7天后再次免疫， 造模21 天。 4.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究 方法， 其特征在于： 所述步骤(3)中黑骨藤提取物的制备方法包括以下步骤： 取黑骨 藤药材， 加乙醇提取， 过 滤， 滤液减压浓 缩， 45℃真空干燥， 即得。 5.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究 方法， 其特征在于： 所述步骤(4)中正常组、 模型组、 黑骨藤组3组大鼠， 于末次给药1h后， 尾 静脉采血， 放入涂有肝素钠的离心管中， 4℃下6000rpm离心10min， 分离取上清液， 分装为 100 μL/支，‑80℃保存。 6.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究 方法， 其特征在于： 所述步骤(5)中前处理包括以下步骤： 取解冻后血浆样本100 μL于1.5mL 的EP管中， 加入甲醇250 μL， 涡混3min， 冰浴10min， 离心； 取血浆甲醇萃取液250 μL， 置GC进样 瓶， N2吹干， 加50 μL的15mg/mL甲氧胺吡啶溶液混匀， 肟化1h， 加50 μL衍生化试剂， 混匀， 衍生 化1h， 冷却后， 转移至1.5mL  EP管中离心， 移取 上清液至内插管中， 备用； 分别取各组解冻血浆样品50μL于同一离心管中， 涡混， 以100μL每管快速分装至1.5mL 离心管中， ‑80℃保存， 作为血浆质控样 本。 每次进样分析 处理时均随行QC样品， QC样 本的制 备方法与血浆样品的制备 方法一致。 7.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究 方法， 其特征在于： 所述步骤(6)中GC ‑MS仪器型号为Agilent7890A/5975C ‑GC/MSD， 色谱柱 为HP‑5MS， 进样体积1 μL； 分流模式为： 不分流； 进样口温度 270℃； EI离子源温度230℃； 传输 线温度280℃； 电子电压为70e  V； 质谱扫描范围m/z  40～600； 程序升温条件起始80℃， 保持 5min； 以6℃.min‑1速度升温至260℃， 保持3min； 以10℃ ·min‑1速度升温至310℃， 保持权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115290797 A 25min。 8.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究 方法， 其特征在于： 所述步骤(7)中在获得GC ‑MS原始数据后， 用Agilent  MSD Chemstation 分析软件将原始数据转换为NetCDF格式， 导入XCMS  Online在线软件进行色谱峰提取、 去 噪、 峰匹配、 保留时间的校正后， 得到三维的数据矩阵表， 得到的数据进行峰面积归一化处 理后采用修正8 0％规则去除数据缺 失值， 将获得的数据利用SIMCA ‑P 14.0软件进行模式识 别分析， 先采用无监督的主成分分析观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定 性， 然后采用有监督的正交偏最小二乘法分析区分各组间代谢轮廓的总体差异， 找到组间 的差异代谢物； 热图、 p ‑Value和VIP ‑plot共同确认对类风湿关节炎组大鼠与正常组大鼠区 组具有显著贡献的差异 代谢产物。 9.根据权利要求1所述的基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究 方法， 其特征在于： 所述步骤(8)中结合S ‑plot图和变量权重值挖掘潜在的差异代谢物， 进 一步利用t检验验证组间差异代谢物是否具有显著性； 一般VIP>1， P<0.05即为潜在的差异 代谢物； 利用NIST数据库对对筛选出的化合物进行定性分析， 选择质谱数据库中匹配度较 高的物质进行分析鉴定， 并通过检索Kyoto  Encyclopedia  ofGenes and Genomes在线数据 库和进行特异性差异性代谢物的结构鉴定， 根据鉴定的差异性代谢物， 整合应用KEGG数据 库进行代谢通路分析， 根据相关通路的分析进一 步对类风湿关节炎致病机理进行解释。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115290797 A 3