(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211111314.X (22)申请日 2022.09.13 (71)申请人 北京豪思生物科技股份有限公司 地址 102200 北京市昌平区回龙观镇科 学 园路7号院1号楼1层102-2 申请人 江苏豪思睦可生物科技有限公司 　 湖南豪思生物科技有限公司 (72)发明人 郑佳　应洪波　栗琳　周继福　 张新星　周立　丁沛瑜　苏营雪　 丁亮　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 张金铭 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01)G01N 30/06(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 高效液相串联质谱同时检测多种抗结核药 物成分的方法 (57)摘要 本发明涉及制药技术领域， 尤其是涉及高效 液相色谱串联质 谱同时检测多种抗结核药物成 分的方法。 本发 明提供的高效液相色谱串联质谱 法高通量检测人血清中四种一类抗结核药物的 方法， 一次检测可同时得到吡嗪酰胺、 异烟肼、 乙 胺丁醇和利福平四种一线抗结核药物， 具有灵敏 度高， 重复性好， 准确性高， 特异性好等特点。 检 测得到的低值质控品重复性的变异系数(CV)≤ 10％， 中值质控品重复性的变异系数(CV)≤ 10％， 高值质控品重复性的变异系数(CV)≤ 10％； 准确度的相对偏差(B)≤ ±15％， 加标回 收 率为98％～1 13％。 权利要求书1页 说明书22页 附图5页 CN 115480008 A 2022.12.16 CN 115480008 A 1.抗结核药物成分分离方法， 其特征在于， 所述抗结核药物成分含有吡嗪酰胺、 异烟 肼、 乙胺丁醇或利 福平中至少一种； 所述分离方法包括， 含有抗结核药物成分的待测样本经甲醇沉淀除杂后， 使用F5色谱 柱或C18色谱柱， 采用甲醇和甲酸铵水溶液配制流动相进行高效液相色谱实现抗结核药物 成分的分离 。 2.根据权利要求1所述的分离方法， 其特征在于， 所述高效液相色谱的流动相A为含有 1/1000(v/v)甲酸的 甲酸铵水 溶液， 所述甲酸铵的浓度为5～15mM； 流动相B为甲醇。 3.根据权利要求2所述的分离方法， 其特征在于， 所述高效液相色谱的流动相条件为， 0 ～2min流动相A的体积比为87％～95％， 2.1～4.5min流动相A的体积比为10％， 4.51～ 5min 流动相A的体积比为95％。 4.根据权利要求3所述的分离方法， 其特征在于， 所述高效液相色谱的检测条件为流动 相流速为0.3～0.6mL/min， 柱温为30～45℃， 进样器温度为5～20℃， 洗针液为体积比为1： (0.5～2)： (0.5～ 2)的甲醇、 乙腈和异丙醇的混合溶 液， 进样量 为1～20 μL。 5.根据权利要求4所述的分离方法， 其特征在于， 所述高效液相色谱的检测条件为流动 相流速为0.5mL/min， 柱温为40℃， 进样器温度为10℃， 洗针液为体积比为1： 1： 1 的甲醇、 乙 腈和异丙醇的混合溶 液， 进样量 为1 μL。 6.根据权利要求1～5任一项所述的分离方法， 其特征在于， 吡嗪酰胺、 异烟肼、 乙胺丁 醇和利福平对应的内标分别为吡嗪酰胺 ‑15N,D3、 异烟肼‑D4、 乙胺丁醇 ‑D4和利福平‑D4。 7.根据权利要求6所述的分离方法， 其特 征在于， 所述待测样本包括人 血清； 优选地， 所述人 血清中血红蛋白浓度小于 0.04g/L。 8.权利要求1～7任一项所述分离方法在药物开发、 药物筛选或科学研究中的应用， 所 述药物含有吡嗪酰胺、 异烟肼、 乙胺丁醇或利 福平中至少一种。 9.抗结核药物成分浓度检测方法， 其特征在于， 所述抗结核药物成分含有吡嗪酰胺、 异 烟肼、 乙胺丁醇或利 福平中至少一种； 所述检测方法包括采用权利要求1～7任一项所述分离方法将待测样本中含有的抗结 核药物成分 分离， 而后经质谱检测得到各成分浓度。 10.根据权利要求9所述的检测方法， 其特征在于， 所述质谱检测的离子源参数为： 离子 源为ESI+， 气帘气压强为30～40psi， 碰撞气压强为medium， 喷雾电压为5500V， 温度为450～ 550℃， 喷雾气GS1压强为 40～55psi， 喷雾气GS2压强为 40～60psi； 优选地， 离子源参数为： 离子源为ESI+， 气帘气压强为40psi， 碰撞气压强为7psi， 喷雾 电压为500V， 温度为5 00℃， 喷雾气GS1压强为5 5psi， 喷雾气GS2压强为6 0psi。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115480008 A 2高效液相串联质谱 同时检测多种抗 结核药物成分的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及制药技术领域， 尤其是涉及高效液相串联质谱同时检测多种抗结核药 物成分的方法。 背景技术 [0002]结核病是病人感染结核分枝杆菌后引起的传染性疾病， 抗结核病的药物主要被分 为四类： 一线抗结核药物、 二线抗结核药物、 新型抗结核药物以及 复方制剂药物。 涉及到的 一线抗结核药物主要包括利福平(Rifamoicin,RMP)、 异烟肼(Isoniazid,INH)、 吡嗪酰胺 (Pyrazinamide,PZA)和乙胺丁醇(Ethambuto l,EMB)。 [0003]抗结核药物测试主要有液相色谱法 ‑紫外法， 液相色谱 ‑蒸发光散射法， 液相色谱 ‑ 串联质谱法等。 由于上述四种一线抗结核药物中乙胺丁醇无紫外吸收， 所以必须带有蒸发 光散射检测器进行检测， 造成四种组分的同时准确检出困难。 [0004]鉴于此， 特提出本发明。 发明内容 [0005]本发明的目的在于， 提供能够同时检测四种抗结核药物组分的高效液相串联质谱 方法， 以解决乙胺丁醇无法用于紫外检测的技 术问题。 [0006]为了解决上述 技术问题， 实现上述目的， 本发明提供了以下技 术方案： [0007]第一方面， 本发明提供抗结核药物成分分离方法， 所述抗结核药物成分含有吡嗪 酰胺、 异烟肼、 乙胺丁醇或利 福平中至少一种； [0008]所述分离方法包括， 含有抗结核药物成分的待测样本经甲醇沉淀除杂后， 使用F5 色谱柱或C18色谱柱， 采用甲醇和甲酸铵水溶液配制流动相进行高效液相色谱实现抗结核 药物成分的分离 。 [0009]在可选的实施方式中， 所述高效液相色谱的流动相A为含有1/1000(v/v)甲酸的甲 酸铵水溶液， 所述甲酸铵的浓度为5～15mM； 流动相B为甲醇。 [0010]在可选的实施方式中， 所述高效液相色谱的流动相条件为， 0～2min流动相A的体 积比为87％～95％， 2.1～4.5min流动相A的体积比为10％， 4.51～5min流动相A的体积比为 95％。 [0011]在可选的实施方式中， 所述高效液相色谱的液相条件为流动相流速为0.3～ 0.6mL/min， 柱温为30～45℃， 进样器温度为5～20℃， 洗针液为体积比为1： (0.5～2)： (0.5 ～2)的甲醇、 乙腈和异丙醇的混合溶 液， 进样量 为1～20 μL。 [0012]在可选的实施方式中， 所述所述高效液相色谱的液相条件为流动相流速为0.5mL/ min， 柱温为40℃， 进样器温度为10℃， 洗针液为体积比为1： 1： 1的甲醇、 乙腈和异丙醇的混 合溶液， 进样量 为1 μL。 [0013]在可选的实施方式中， 吡嗪酰胺、 异烟肼、 乙胺丁醇和利福平对应的内标分别为吡 嗪酰胺‑15N,D3、 异烟肼‑D4、 乙胺丁醇 ‑D4和利福平‑D4。说　明　书 1/22 页 3 CN 115480008 A 3