(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210288197.8 (22)申请日 2022.03.23 (71)申请人 厦门大学 地址 361000 福建省厦门市思明南路42 2号 (72)发明人 李剑锋　关鹏程　顾曼曼　 (74)专利代理 机构 厦门市首创君 合专利事务所 有限公司 3 5204 专利代理师 张松亭　游学明 (51)Int.Cl. G01N 21/65(2006.01) G01N 21/01(2006.01) (54)发明名称 一种二维平面结合SERS检测新冠病毒SARS- CoV-2抗原的方法 (57)摘要 本发明公开了一种二维平面结合SERS检测 新冠病毒SARS ‑CoV‑2抗原的方法， 属于生物技术 领域。 本发明检测方法利用新冠病毒SARS ‑CoV‑ 2S蛋白‑核酸适配体特异性识别的原理， 通过附 着新冠病毒SARS ‑CoV‑2S蛋白免疫金纳米 粒子的 二维平面与S蛋白发生特异性免疫之后， 再与免 疫金信号纳米粒子结合， 构筑成三明治结构； 然 后通过便携式拉曼光谱仪， 可以直接测出其SERS 信号， 且实现了对新冠病毒SARS ‑CoV‑2S蛋白低 至1TU/ml的超高检测灵 敏度。 通过上述方式不但 不需要进行核酸提取或依赖抗体进行检测， 而且 能在较短时间内特异性超灵敏的检测出新冠病 毒SARS‑CoV‑2蛋白， 为初期筛查感染新冠病毒 SARS‑CoV‑2S的病原创造 了有利、 有效的方式。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 114739974 A 2022.07.12 CN 114739974 A 1.一种二维平面结合SERS检测新冠病毒SARS ‑CoV‑2抗原的方法， 包括如下步骤： 1)制备拉曼 金属纳米粒子； 2)拉曼金属纳米粒子与拉曼报告分子混合， 室温孵育1 ‑10分钟， 离心， 弃去上层清液， 重新分散在PBS ‑T溶液中， 再与SARS ‑CoV‑2的适配体混合后， ‑20℃下冷冻1 ‑5h， 解冻后， 用 PBS‑T洗涤数次后， 加入TBS溶液封 闭剩余活性位点， 室温孵化， 离心， 用PBS ‑T溶液洗涤数 次， 最后弃去上层清液， 重新分散在PBS ‑T溶液中， 获得免疫金属信号纳米粒子； 3)取金属纳米粒子， 离心， 弃去上清液， 重新分散在去离子水中， 再与巯基修饰的SARS ‑ CoV‑2适配体混合后， ‑80℃下冷冻 0.5‑5h， 解冻后， 获得增强信号金属纳米粒子； 取上述增 强信号金属纳米粒子， 滴在二维平面上， 烘箱30℃ ‑55℃烘干， 放入PBS和TBS混合液， 室温下 封闭， 取出， 用PBS ‑T溶液洗涤， 制得附着新冠病毒SARS ‑CoV‑2S蛋白增强信号金属纳米粒子 的二维平面； 4)取待测样品， 滴到附着免疫纳米粒子的二维平面上， 再滴入步骤2)的免疫金属信号 纳米粒子， 室温孵 育， PBS溶 液洗涤数次， 构筑成三明治夹心结构； 5)拉曼检测。 2.如权利要求1所述的方法， 其特 征在于， SARS ‑CoV‑2适配体采用S蛋白核酸 适配体。 3.如权利要求2所述的方法， 其特征在于， 步骤2)中所述的S蛋白核酸适配体S   Aptamer1为5 ‑CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTG GTCCAAGGGCGTTAATGGACA‑3。 4.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的拉曼金属纳米粒子通过以下方法制 得： 取200mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾； 然后取2 ‑4mL质量 分数为1％柠檬酸钠溶液， 加入沸腾的氯金酸溶液中， 待沸腾20 ‑30min反应结束， 冷却 至室 温， 制成纳米金 溶胶。 5.如权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的金属纳米粒子的粒径为30 ‑35nm,紫外 吸收波长为5 36nm。 6.如权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述的二维平面是渡有金膜的硅片。 7.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的洗涤液PBS ‑T为： PBS溶液中加入浓度 为10‑50mM的MgCl2及浓度为0.01％ ‑1％的吐温 ‑20。 8.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的免疫金属信号纳米粒子制备中， 将50 ‑ 100ul金纳米粒子与2 ‑8ul 30uM NBA溶液混合， 室温孵化1 ‑10分钟。 9.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤5)包括步骤： 将病毒样本滴在制得的附 着新冠病毒SARS ‑CoV‑2S蛋白增强信号金属纳米粒子的二维平面上反应后， 再滴免疫金属 信号纳米粒子反应， 室温孵育， PBS ‑T(MgCl2)溶液洗， 直接进行拉曼检测， 在 1‑30分钟内实 现新冠抗原的快速检出拉曼光谱结果。 10.如权利要求9所述的方法， 其特征在于， 拉曼光谱仪为便携式拉曼光谱仪， 激发波长 为785nm。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114739974 A 2一种二维平面 结合SERS检测新冠病毒SARS ‑CoV‑2抗原的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种二维平面结合SERS检测新冠病毒SARS ‑CoV‑2抗原的方法。 背景技术 [0002]新型冠状病毒肺炎疫情的全球大流行， 对全球公共健康、 社会和经济运转造成了 重大影响。 在药物研发迟滞及疫苗有效性未得到充分验证的情况下， 对人群进行大规模的 快速筛查， 寻找潜在的感染者(尤其是轻症和无症状患者)， 并进 行集中隔离， 切断传播途径 和保护易感人群是 首要的任务。 因此对于新冠病毒SARS ‑CoV‑2感染， 早期诊断尤为重要。 [0003]SARS‑CoV‑2的临床诊断依赖于既往接触史、 临床表现和实验室检测， 包括拭子核 酸/抗原检测、 血清学检测等来对新冠感染进行确诊。 由于冠病毒的复杂性， 联合采用多种 技术可以有效提高诊断的准确性。 总的来说， 核酸检测仍然 是新冠诊断的金标准， 但其存在 耗时较长、 无法现场检测的缺点。 血清学检测最主要的特点是检测耗时短、 准确性高， 但只 有在患者感染后 1周后才产生可被检测的抗体。 而抗原检测利用针对新冠抗原蛋白制备 的 特异性单克隆抗体， 对呼吸道、 消 化道等样本中的新冠抗原蛋白进行直接检测， 兼具方便、 快速和低价且灵敏度较高的优势， 可对刚出现感染症状的患者进行及时检测， 可对疑似人 群进行早期分流和快速管理。 但是， 抗原检测的灵敏度和特异性急需提高。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一种基于核酸适配体识别的二维平面结合SERS检测新冠病 毒SARS‑CoV‑2抗原的方法。 [0005]为了实现上述目的， 本发明采用如下的技 术方案： [0006]一种二维平面结合SERS检测新冠病毒SARS ‑CoV‑2抗原的方法， 包括如下步骤： [0007]1)制备拉曼 金属纳米粒子； [0008]2)拉曼金属纳米粒子与拉曼报告 分子混合， 室温孵育 1‑10分钟， 离心， 弃去上层清 液， 重新分散在PBS ‑T(MgCl2)溶液中， 再与SARS ‑CoV‑2的适配体混合后， ‑20℃下冷冻1 ‑5h， 解冻后， 用PBS ‑T(MgCl2)洗涤数次后， 加入TBS溶液封闭剩余活性位点， 室温孵化， 离心， 用 PBS‑T(MgCl2)溶液洗涤数次， 最后弃去上层清液， 重新分散在PBS ‑T(MgCl2)溶液中， 获得免 疫金信号纳米粒子； [0009]3)取金属纳米粒子， 离心， 弃去上清液， 重新分散在去离子水中， 再与巯基修饰 的 SARS‑CoV‑2适配体混合后， ‑80℃下冷冻0.5 ‑5h， 解冻后， 获得增强信号金纳米粒子； 取上述 增强信号金纳米粒子， 滴在二维平面上， 烘箱30℃ ‑80℃烘干， 放入PBS和TBS混合液， 室温下 封闭， 取出， 用PBS ‑T(MgCl2)溶液洗涤， 制得所述的增强型捕获新冠SARS ‑CoV‑2病毒的二维 平面基底； [0010]4)取待测样品， 滴到增强型捕获新冠SARS ‑CoV‑2病毒的二维平面基底， 再滴入步 骤2)的免疫金信号纳米粒子， 室温孵 育， PBS溶 液洗涤数次， 构筑成三明治夹心结构； [0011]5)拉曼检测。说　明　书 1/5 页 3 CN 114739974 A 3