(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111416542.3 (22)申请日 2021.11.25 (66)本国优先权数据 202111301672.2 2021.1 1.04 CN (71)申请人 天津大学浙江研究院 地址 315200 浙江省宁波市镇海区中官西 路85号 (72)发明人 仰大勇　姚池　郭蕴华　 (74)专利代理 机构 苏州三英知识产权代理有限 公司 32412 代理人 朱如松 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) C12P 19/34(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01)A61K 35/17(2015.01) A61K 47/26(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 DNA网络水凝胶、 制备方法及其组合物 (57)摘要 本发明公开了DNA网络水凝胶、 制备方法及 其组合物， 网络水凝胶， 包括网络水凝胶载体， 具 有DNA链所形成的网络结构； HhaI@TGMS纳米颗 粒， 负载于所述网络水凝胶载体。 本发明赋予了 DNA网络降解及T细胞释放的可控性， 从而实现了 对细胞表 面的免疫检查点的阻断及肿瘤T淋巴细 胞的响应性释放， 成功应用于肿瘤免疫治疗， 在 黑色素瘤小鼠模型中发挥了 显著的免疫 疗效。 权利要求书1页 说明书15页 序列表3页 附图1页 CN 114107198 A 2022.03.01 CN 114107198 A 1.一种DNA网络水凝胶， 其特 征在于， 包括 网络水凝胶载体， 具有DNA 链所形成的网络结构； HhaI@TGMS纳米颗粒， 负载于所述网络水凝胶载体。 2.如权利 要求1所述的DNA网络水凝胶， 其特征在于， 所述网络水凝胶载体至少由RCA产 物一、 RCA产物二共混后形成， 所述RCA产物一、 RCA产物二共混的体积比为1： (1 ‑5)， 其中， 所述RCA产物一其组成至少包 括， 以每100微升计： (5 ×10‑3～1×10‑2)nmol的环状DNA模 板一、 (3～ 5)U的phi  29DNA聚合酶、 终浓度为1 ×phi 29DNA聚合酶缓冲液、 终浓度为(0.1～ 0.4)微克/微升的BSA、 (0.0 5～0.1)nmo l的dNTPs、 终浓度(6 0～80)mmol/L的NaCl； 所述RCA产物二其组成至少包 括， 以每100微升计： (5 ×10‑3～1×10‑2)nmol的环状DNA模 板二， (3～ 5)U的phi  29DNA聚合酶， 终浓度为1 ×phi29 DNA聚合酶缓冲液， 终浓度为(0.1～ 0.4)微克/微升的BSA， (0.0 5～0.1)nmo l的dNTPs， 终浓度(6 0～80)mmol/L的NaCl。 3.如权利 要求2所述的DNA网络水凝胶， 其特征在于， 所述环状DNA模板一为由具有末端 缺口的环状DNA ‑1与T4 DNA连接酶反应获得， 所述环状DNA ‑1为经5’端磷酸化修饰的ssDNA ‑ 1和引物一反应获得， 所述ssDNA ‑1的碱基数为95～130， 所述引物一的碱基数为20～37， 并 且所述ssDNA‑1的5’端和3’端分别与引物一的3 ’端和5’端互补配对。 4.如权利 要求1所述的DNA网络水凝胶， 其特征在于， 所述环状DNA模板二为由具有末端 缺口的环状DNA ‑2与T4 DNA连接酶反应获得， 所述环状DNA ‑2为经5’端磷酸化修饰的ssDNA ‑ 2和引物二反应获得， 所述ssDNA ‑2的碱基数为95～130， 所述引物二的碱基数为20～37， ssDNA‑2的5’端和3’端分别与引物二的3 ’端和5’端互补配对。 5.如权利要求1所述的DNA网络水凝胶， 其特征在于， 所述HhaI@TGMS纳米颗粒为： 在 1.5mL离心管中混合50U的Hh aI和480～500 μL  0.5mg/mLTGMS， 之后在pH＝7～9的磷酸盐缓 冲液中在4℃条件下超声1小时， 分离获得。 6.如权利要求1所述的DNA网络水凝胶， 其特征在于， 所述HhaI@TGMS纳米颗粒为： 混合 50U的HhaI和480～500 μL  0.5mg/mL  TGMS， 再在pH＝7 ‑9的磷酸盐缓冲液中在0～ 6℃条件下 超声0.5‑2小时， 分离获得。 7.如权利要求1～6任一所述的DNA网络水凝胶的制备方法， 其特征在于， 包括如下步 骤： 获取DNA网络水凝胶， 构建网络水凝胶载体； 所述网络水凝胶载体吸附H haI@TGMS纳米颗粒。 8.DNA网络水凝胶组合物， 包括如权利要求1～6任一所述的DNA网络水凝胶。 9.根据权利 要求8所述的DNA网络水凝胶组合物， 其特征在于， 还包括由所述DNA网络水 凝胶捕获的T淋巴细胞。 10.根据权利 要求9所述的DNA网络水凝胶组合物， 其特征在于， 所述DNA网络水凝胶对T 淋巴细胞的捕获为： 将含有T淋巴细胞的细胞液与RCA产物 一共孵育后， 再与RCA产物二混合 孵育。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114107198 A 2DNA网络水凝胶、 制备方 法及其组合物 [0001]在先申请日： 2021/1 1/4 [0002]在先申请号： 2021 113016722 技术领域 [0003]本发明是关于生物制药技术， 特别是关于一种D NA网络水凝胶、 制备方法及其组合 物。 背景技术 [0004]肿瘤免疫疗法是一种新兴的癌症治疗方法， 它旨在激活 改善患者自身的免疫系统 攻击肿瘤细胞。 与传统的手术疗法、 化学疗法相比， 具有更强的系统性以及更低的全身毒 性。 近年来肿瘤免疫治疗取得了重大突破， 但实体瘤 存在肿瘤免疫抑制微环境， 大大降低了 现有免疫治疗技术的有效性。 例如， 肿瘤细胞产生的程序性死亡配体 ‑1(PD‑L1)能够通过与 T细胞上的PD ‑1受体结合， 抑制T细胞 活化， 从而降低免疫疗效。 近年来研究者们正在不断探 索各种打破肿瘤 免疫抑制微环境的方法， 以提高现有免疫治疗技术的有效性。 目前开发的 各种大分子药物， 如抗PD ‑L1抗体等， 不仅存在费用较高的问题， 并且可能会引起 自身免疫 性炎症等副作用。 [0005]公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不应 当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域 一般技术人员所公知的现有技 术。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种DNA网络水凝胶、 制备方法及其组合物， 旨在使DNA网 络水凝胶分离肿瘤T淋巴细胞， 对其表面的免疫检查点进行封锁， 并通过酶响应释放T淋巴 细胞， 提高肿瘤免疫 治疗效果。 [0007]说明， 在本发明中， 技术术语某一组分终浓度是指该组分所在的体系完成最终配 制时所体现的浓度， 比如RCA产物一中NaCl的终浓度， 即为RCA产物一完成品中NaCl的浓度。 [0008]为实现上述目的， 本发明的实施例提供了DNA网络水凝胶， 包括网络水凝胶载体， 具有DNA链所形成的网络结构； H haI@TGMS纳米颗粒， 负载于所述网络水凝胶载体。 [0009]在本发明的一个或多个实施方式中， 网络水凝胶载体至少由RCA产物一、 RCA产物 二共混后形成， 所述RCA产物一、 RCA产物二共混的体积比为1： (1 ‑5)， 其中， 所述RCA产物一 其组成至少包括， 以每100微升计： (5 ×10‑3～1×10‑2)nmol的环状DNA模板一、 (3～5)U的 phi29DNA聚合酶、 终浓度为1 ×phi29DNA聚合酶缓冲液、 终浓度为(0.1～0.4)微克/微升的 BSA、 (0.05～ 0.1)nmol的dNTPs、 终浓度(60～80)mmol/L的NaCl； 所述RCA产物二其组成至少 包括， 以每100微升计： (5 ×10‑3～1×10‑2)nmol的环状DNA模板二， (3～5)U的phi29DNA聚 合酶， 终浓度为1 ×phi29DNA聚合酶缓冲液， 终浓度为(0.1～0.4)微克/微升的BSA， (0.05～ 0.1)nmol的dNTPs， 终浓度(6 0～80)mmol/L的NaCl。 [0010]本发明的“1×”表示1倍量， 是以市售产品按照说明进行补齐稀释后获得， 下同。说　明　书 1/15 页 3 CN 114107198 A 3