(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111416905.3 (22)申请日 2021.11.25 (71)申请人 徐州医科 大学 地址 221000 江苏省徐州市 云龙区铜山路 209号 (72)发明人 杨洁　柴大飞　郑骏年　姚宏　 刘玲　 (74)专利代理 机构 西安铭泽知识产权代理事务 所(普通合伙) 61223 代理人 崔瑞迎 (51)Int.Cl. A61K 38/16(2006.01) A61K 47/69(2017.01) A61P 35/00(2006.01) B82Y 5/00(2011.01)B82Y 40/00(2011.01) C12N 15/31(2006.01) C12N 15/70(2006.01) (54)发明名称 H1-pHSP65纳米疫苗及其制备方法和用途 (57)摘要 本发明涉及疫苗制备技术领域， 具体公开了 H1‑pHSP65纳米疫苗及其制备方法和用途， 通过 pHSP65质粒的构建， 进一步制备获得H1 ‑pHSP65 纳米疫苗， 具体是将H1纳米载体包裹HSP65质粒 DNA形成H1 ‑pHSP65纳米颗粒。 本发明制备的H1 ‑ pHSP65纳米颗 粒能够用于制备抗肿瘤药物， 能够 抑制肿瘤细胞的增殖和转移， 能够有效激发小鼠 的肿瘤免疫反应 。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 CN 114099639 A 2022.03.01 CN 114099639 A 1.H1‑pHSP65纳米疫苗的制备 方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1， pHSP65质粒的构建： 根据HSP65序列设计引物， 以pET28a ‑HSP65质粒为模板扩增得 HSP65序列， 以pcDNA3.1为 真核表达载体， NcoI和EcoRI为酶切位点、 插入HSP65序列， 构建得 pHSP65质粒； S2， H1‑pHSP65纳米疫苗 的制备： 将质粒pHSP65转化入DH5a大肠杆菌感受态细胞， 培养 后提取质粒， 将pHSP 65质粒和H1纳米载体分别溶于PBS， 静置5分钟后混合， 静置10分钟后即 得H1‑pHSP65纳米疫苗。 2.根据权利 要求1所述的H1 ‑pHSP65纳米疫苗的制备方法， 其特征在于， S1中， 所述引物 包括F引物和R引物； 所述F引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 所述R引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 3.根据权利要求1所述的H1 ‑pHSP65纳米疫苗的制备方法， 其特征在于， S2中， 质粒 pHSP65转化入DH5a大肠杆菌感受态细胞后培 养温度为37℃。 4.根据权利要求3所述的H1 ‑pHSP65纳米疫苗的制备方法， 其特征在于， S2中， H1 ‑ pHSP65基因纳米疫苗是将H1纳米载体包裹HS P65质粒DNA形成H1 ‑pHSP65纳米颗粒。 5.由权利要求1 ‑4任一项所述的制备 方法制备 得到的H1 ‑pHSP65纳米疫苗。 6.权利要求5所述的H1 ‑pHSP65纳米疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。 7.包含权利要求5所述的H1 ‑pHSP65纳米疫苗的疫苗注射剂。 8.权利要求7 所述的疫苗注射剂在制备抗肿瘤药物中的应用。 9.权利要求8所述的疫苗注射剂在制备抗肿瘤药物中的应用， 其特征在于， 所述疫苗注 射剂包括但不限于用于制备抗肾癌的药物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114099639 A 2H1‑pHSP65纳米疫苗及其制备方 法和用途 技术领域 [0001]本发明属于疫苗制备技术领域， 具体涉及H1 ‑pHSP65纳米疫苗及其制备方法和用 途。 背景技术 [0002]DNA疫苗在肿瘤疫苗中占有重要地位， 是近年研究的热点之一。 肿瘤DNA疫苗是利 用基因工程技术将肿瘤相关抗原的基因负载到质粒载体上， 借助载体或者人体基因表达系 统， 能持续引起较强的体液免疫和细胞免疫， 达 到预防和治疗 疾病的目的。 [0003]HSP65(heat shock protein 65kD)是来源于卡介苗的热休克蛋白， 是卡介苗的主 要抗原之一， 国际基因库登录号是M17705。 卡介苗早在60年代即通过BCG膀胱内灌注用于浅 表性膀胱癌的临床治疗， 不仅可消灭原位癌， 还可以预防肿瘤复发。 但是， BCG 的成分复杂， 会引起一系 列的毒副作用。 许多肿瘤会过量表达和分泌HSP60蛋白， HSP 60与肿瘤的发生、 发 展、 转移有关， 可以作为肿瘤靶 标之一， 但是内源性HSP60的免疫原性较差。 HSP65是HSP60家 族成员， 与HSP60具有高度同源性(高于55％)。 HSP65具有多重的T表位和B表 位， 具有强免疫 原性， 能刺激 机体同时产生体液免疫和细胞免疫。 [0004]但是， 核酸分子量较大、 带负电等性质导致裸露DNA很难自主进入细胞， 并且体内 易降解， 不能有效突破内皮细胞在血管腔内形成屏障， 不能进入血管外的免疫细胞， 从而阻 碍特异性免疫反应的诱 导。 [0005]纳米载体H1(PEI600‑CyD‑FA)是将阳离子聚合物聚乙烯亚胺PEI600通过环糊 精CyD 修饰和偶合叶酸FA配体修饰后得到的新型纳米复合物。 H1不仅具有低毒、 低免疫原 性、 水溶 性好、 生物相容性好的特点， 可与带负电荷的细胞膜或质粒DNA通过静电天然吸附， 具有增 强细胞黏附吸收作用， 促进胞间运输、 缓释、 基因转染效率高等多种良好特性； 还能引起高 水平的DC对抗原的摄取作用和更强的抗原交叉递呈作用， 能显著 提高抗原特异 性CTL活性， 增强抗原特异性的体液免疫及细胞免疫应答。 由于H1具有DNA结合能力强、 载体转染效率 高、 基因表达能力高、 安全低毒等特点， 适 合作为基因疫苗的递呈 载体。 发明内容 [0006]本发明的目的是提供了H1 ‑pHSP65纳米疫苗及其制备方法和用途， 通过热休克蛋 白65/HSP65(国际基因库登录号是M17705)的基因联合H1(PEI600‑CyD‑FA)纳米载体构建获 得H1‑pHSP65纳米疫苗， 制备得到的H1 ‑pHSP65纳米疫苗能够用于制备抗肿瘤药物， 能够更 有效的被机体吸 收， 增强其免疫原性。 [0007]本发明提供了 H1‑pHSP65纳米疫苗的制备 方法， 具体包括如下步骤： [0008]S1， pHSP65质粒的构建： 根据HSP65序列设计引物， 扩增得HSP65序列， 以pcDNA3.1 为真核表达载体构建得pHS P65质粒； [0009]S2， H1‑pHSP65纳米疫苗的制备： 将质粒pHSP65转化入DH5a大肠杆菌感受态细胞， 培养后提取质粒， 将pHSP65质粒和H1纳米载体 分别溶于PBS， 静置5分钟后混合， 静置10分钟说　明　书 1/4 页 3 CN 114099639 A 3