(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111314512.1 (22)申请日 2021.11.08 (71)申请人 苏州博领干细胞再生医学有限公司 地址 215000 江苏省苏州市苏州工业园区 若水路38 8号D201室 (72)发明人 陆毅　刘景晶　 (74)专利代理 机构 上海宏京知识产权代理事务 所(普通合伙) 31297 代理人 李倩倩 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A61K 39/385(2006.01) A61K 39/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种融合蛋白、 重组工程菌及培养方法、 抗 胰高血糖素相关肽-2疫苗的纯化方法 (57)摘要 本发明涉及基因工程技术领域， 特别是涉及 一种融合蛋白、 重组工程菌及培养方法、 抗胰高 血糖素相关肽－2疫苗的纯化方法， 融合蛋白包 含TTP和GLP ‑2。 本发明构建了一种抗胰高血糖 素 相关肽－2的疫苗(AnsB ‑TTP‑GLP‑2)， 并采用硫 酸铵沉淀以及离子交换层析等方法对该蛋白进 行了纯化。 该疫苗免疫BALB/c小鼠， 在弗氏佐剂 的帮助下 可诱导机体产生抗GLP‑2的抗体。 权利要求书1页 说明书11页 序列表1页 附图8页 CN 113912741 A 2022.01.11 CN 113912741 A 1.一种门冬酰胺酶－破伤风毒素T细胞辅助表位－胰高血糖素样肽 ‑2融合蛋白， 其特 征在于， 包 含TTP和GLP‑2。 2.一种门冬酰胺酶－破伤风毒素T细胞辅助表位－胰高血糖素样肽 ‑2重组工程菌， 其 特征在于， 所述重组基因工程菌是将包 含TTP和GLP‑2的质粒转入大肠杆菌获得。 3.一种表达抗胰高血糖素相关肽－2疫苗的工程菌的培养方法， 其特征在于， 包括如下 步骤： 步骤一、 将权利要求2所述的门冬酰胺酶－破伤风毒素T细胞辅助表位－胰高血糖素样 肽‑2重组工程菌的单菌落接入第一 LB培养液中， 在3 5～40℃下培 养； 步骤二、 按照0.5～2％的比例转接入第二LB培养液中， 第二LB培养液中加入终浓度为 1.5～3mg/ml的葡萄糖， 在3 5～40℃培 养； 步骤三、 在第二 LB培养基中加入诱 导剂， 在3 0℃下低温诱 导培养， 离心收集菌体， 即得； 其中， 所述第一 LB培养液中含有0.3～0.7w/v％的NaCl， 40～6 0 μg/ml的卡那霉素。 4.根据权利要求3所述的一种表达抗胰高血糖素相关肽－2疫苗的工程菌的培养方法， 其特征在于， 所述步骤一中第一LB培养液包括如下组分： 0.8～1.2w/v％的胰蛋白胨， 0.3～ 0.7w/v％的酵母抽提物， 0.3～0.7w/v％的NaCl， 40～6 0 μg/ml的硫酸 卡那霉素； 所述步骤二中第二LB培养液包括如下组分： 0.8～1.2w/v％的胰蛋白胨， 0.3～0.7w/ v％的酵母抽提物， 0.3～0.7w/v％的NaCl， 40～60 μg/ml的硫酸卡那霉素， 1.5～ 3mg/ml的葡 萄糖。 5.根据权利要求3或4所述的一种表达抗胰高血糖素相关肽－2疫苗的工程菌的培养方 法， 其特征在于： 所述步骤一中第一LB培养液包括如下组分： 1.0w/v％的胰蛋白胨， 0.5w/ v％的酵母抽提物， 0.5w/v％的NaCl， 5 0 μg/ml的硫酸 卡那霉素； 所述步骤二中第二LB培养液包括如下组分： 1.0w/v％的胰蛋白胨， 0.5w/v％的酵母抽 提物， 0.5w/v％的NaCl， 5 0 μg/ml的硫酸 卡那霉素， 2mg/ml的葡萄糖。 6.根据权利要求3所述的一种表达抗胰高血糖素相关肽－2疫苗的工程菌的培养方法， 其特征在于： 所述 步骤一和步骤二培 养温度为37℃； 所述步骤二中接种比例为1％。 7.根据权利要求3所述的一种表达抗胰高血糖素相关肽－2疫苗的工程菌的培养方法， 其特征在于： 所述 步骤三中诱 导剂为乳糖， 乳糖浓度为1.5～ 2.0mg/ml。 8.根据权利要求7所述的一种表达抗胰高血糖素相关肽－2疫苗的工程菌的培养方法， 其特征在于： 所述 步骤三中诱 导剂为乳糖， 乳糖浓度为1.8mg/ml。 9.一种抗胰高血糖素相关肽－2疫苗的纯化方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 将权利要求3～8任一项所述菌体进行裂解； S2、 向裂解上清液中加入 硫酸铵至 饱和度为23～ 27％， 弃沉淀； S3、 向上清液中再加入硫酸铵至饱和度 为53～57％饱和度， 静置、 离心， 弃上清， 沉淀 复 溶于离子交换缓冲液进行透析， 弃沉淀； S4、 将S3制得的上清液进行柱层析分离， 收集含有目的蛋白的洗脱液， 再用蒸馏水透 析， 弃沉淀， 上清冻干， 即得。 10.根据权利要求9所述的一种抗胰高血糖素相关肽－2疫苗的纯化方法， 其特征在于： 所述S2中硫酸铵的饱和度为25％， 所述S3中硫酸铵的饱和度为5 5％。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113912741 A 2一种融合蛋白、 重组工 程菌及培养方 法、 抗胰高血糖素相关 肽‑2疫苗的纯化方 法 技术领域 [0001]本发明涉及基因工程技术领域， 特别是涉及一种融合蛋白、 重组工程菌及培养方 法、 抗胰高血糖素相关肽 ‑2疫苗的纯化方法。 背景技术 [0002]胰高血糖素样肽 ‑2(glucagons ‑like peptide 2， GLP‑2)是由33个氨基酸组成 的 单链多肽， 分子量约为39 00道尔顿。 其氨 基酸序列为： HADGSFSDEM  NTILDNLAAR  DFINWLIQTK   ITD。 GLP‑2的生成见图1。 胰高血糖素原包含了一些明确的多效性的肽段， 包括肠高血糖素 (glicentin)， 胰高血糖素(glucagon)， 胃泌酸调 节素(oxyntomodulin)和两种胰高血糖素 样肽(GLP)， 还有两种间隔肽(intervening  peptide)， 哺乳动物胰高血糖素原的结构见图 2； 其中胰高血糖素， 胰高血糖素样肽 ‑1， 胰高血糖素样肽 ‑2都是通过明确的受体发挥作用 的。 [0003]GLP‑2作为一种胃肠激素又是神经肽的一种， 故很可能在某些肿瘤细胞的生长过 程中发挥着作用。 但目前对GLP ‑2的研究主要集中在其对肠 粘膜的作用上， 对其免疫原性以 及与肿瘤关系的研究则未 见有报道。 发明内容 [0004]鉴于以上所述现有技术的缺点， 本发明的目的在于提供一种门冬酰胺酶 ‑破伤风 毒素T细胞辅助表位 ‑胰高血糖素样肽 ‑2融合蛋白， 用于解决现有技术中GLP ‑2的研究主要 集中在其对肠粘膜的作用上， 对其免疫原性以及与肿瘤关系没有深入研究并且没有采用 GLP‑2制备相关疫苗的问题， 同时， 本发明还将提供一种门冬酰胺酶 ‑破伤风毒素T细胞辅助 表位‑胰高血糖素样肽 ‑2重组工程菌； 此外， 本发明还将提供一种表达抗胰高血糖素相关 肽‑2疫苗的工程菌的培 养方法， 一种抗胰高血糖素相关肽 ‑2疫苗的纯化方法。 [0005]为实现上述目的及其 他相关目的， [0006]本发明的第一方面， 提供一种门冬酰胺酶 ‑破伤风毒素T细胞辅助表位 ‑胰高血糖 素样肽‑2融合蛋白(AnsB ‑TTP‑GLP‑2， 简称为ATG2)， 包含TTP和GLP ‑2。 P2、 P21、 P2 3、 P30、 P32 均为破伤风毒素辅助性T细胞表位， 其氨基酸序列分别为： P2、 QYIKANSKFIGITE； P21、 IREDNNITLKLDRCNN； P23、 VSIDKFRIFCKANPK； P30、 FNNFTVSFWLRVPKVVSASHLE； P32、 LKFIIKRYTPNNEIDS。 上述破伤风毒素辅助性T细胞表位， 其氨基酸序列还可以为CQYIKANSK FIGITELIYSYFPSVISSGTHGDGSF。 [0007]胰高血糖素样肽 ‑2(glucagons ‑like peptide 2， GLP‑2)是由33个氨基酸组成 的 单链多肽， 分子量约为39 00道尔顿。 其氨 基酸序列为： HADGSFSDEM  NTILDNLAAR  DFINWLIQTK   ITD。 [0008]本发明的第二方面， 提供一种门冬酰胺酶 ‑破伤风毒素T细胞辅助表位 ‑胰高血糖 素样肽‑2重组工程菌， 所述重组基因工程菌是将包含TTP和GLP ‑2的质粒转入大肠杆菌获说　明　书 1/11 页 3 CN 113912741 A 3