ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1610—2019 黄花矶松组织培养技术规程 Technical regulation of tissue culture of limonium aureum 2019-03-15 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2019-06-15 实施 发 布 DB15/T 1610—2019 目 次 前言 ................................................................................ Ⅱ 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 实验室要求与设施 .................................................................. 1 4 培养基的制备 ...................................................................... 1 5 组织培养过程 ...................................................................... 2 附录 A（资料性附录） B5 基础培养基成分 ............................................... 4 I DB15/T 1610—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司提出。 本标准由内蒙古自治区草原生态修复标准化技术委员会(SAM/TC34)归口。 本标准起草单位：内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司。 本标准主要起草人：高秀梅、田志来、马怀林、张永清、李晶晶、白俊梅、崔海鹏、刘思泱。 II DB15/T 1610—2019 黄花矶松组织培养技术规程 1 范围 本标准规定了黄花矶松组织培养中的实验室要求与设施、培养基的制备和组织培养过程。 本标准适用于内蒙古地区黄花矶松组培苗的规模化育苗生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 NY/T 2306-2013 花卉种苗组培快繁技术规程 3 实验室要求与设施 实验室设计与设施按照 NY/T 2036-2013，4.1.3 执行。 4 培养基的制备 4.1 培养基的配制 B5 培养基母液的配制顺序参见附录 A，配制使用蒸馏水。大量元素按照比使用浓度高 10～100 倍进 行配制，微量元素按照比使用浓度高 20～1000 倍进行配制，作为贮备液。 4.2 植物生长调节剂母液的配制 4.2.1 配制 植物生长调节剂母液的配制浓度为 KT 0.2 mg/L～0.8 mg/L、NAA 0.05 mg/L～0.1 mg/L、2,4-D 0.02 mg/L～0.08 mg/L、IBA 0.1 mg/L。 4.2.2 保存 配制好的母液贴上标签，注明名称和日期，保存于约 4 ℃冰箱中，尽快使用。 4.2.3 其他物质 用 3 g/L～5 g/L 卡拉胶作固化剂，25 g/L～35 g/L 的食用白糖代替蔗糖作为碳源。 1 DB15/T 1610—2019 4.3 培养基的制作 4.3.1 母液配制 烧杯中加入3 g/L～5 g/L卡拉胶，25 g/L～35 g/L的食用白糖，按照附录A依次取大量元素、微量 元素、铁盐、有机成分，根据生长要求加入植物生长调节剂（不耐高温的药品，应在培养基灭菌后再过 滤灭菌加入），贴上标签，注明名称和日期，保存于4 ℃冰箱中，尽快使用。 4.3.2 定容 取出母液，用玻璃棒搅拌混匀，加入沸腾的自来水并不断搅拌使卡拉胶和糖溶解，加水至容器刻度 （1 L 或 10 L）。 4.3.3 pH 调试 定容后用 0.1 mol/L 的 HCl 或 NaOH 溶液，调节 pH 为 5.8～6.0。配置溶液方法按照 GB/T 603 执行。 4.3.4 分装 将调节好的培养基根据不同需求进行分装，诱导培养基规格为容量 300 ml 的培养瓶，每瓶分装 40 ml～50 ml；增殖培养基规格为容量 300 ml 的培养瓶，每瓶分装 40 ml～50 ml；生根培养基，每瓶分 装 30 ml～40 ml。 4.3.5 封口 分装好的培养瓶用封口膜或者瓶盖进行封口，并用绳子扎紧或拧紧。 4.3.6 灭菌 将封口后的培养瓶在 121 ℃中灭菌 20 min～25 min。 4.3.7 存储 灭菌后的培养基应标明编号及日期，冷却和凝固后放置观察 2d～3d，按灭菌先后顺序使用，且存 储时间不超出一个月。 5 组织培养过程 5.1 外植体的选取及灭菌 5.1.1 外植体选取 5.1.2 外植体灭菌 外植体灭菌流程为： a) 用流水冲洗 30 min～40 min； b) 转入超净工作台，吸水纸吸去水分后在 70 %～75 %酒精中处理 1 min～2 min，再用 0.1 %的 升汞溶液处理 8 min～10 min； c) 无菌水淋洗 6～7 次，用已灭菌的滤纸吸干，接种在备好的培养基中。 2 DB15/T 1610—2019 5.2 培养条件 培养温度为 25 ℃±2 ℃；光照强度为 1500 Lx～2000Lx；光照时间为 12 h/d～16 h/d。 5.3 初代培养 将外植体接种到 B5+KT 0.2 mg/L～0.8 mg/L + NAA 0.05 mg/L～0.1 mg/L+2,4-D 0.02 mg/L～0.08 mg/L 初代诱导培养基上，培养 15 d 后产生愈伤组织，20 d 左右可产生结构紧密，淡绿色的不定芽。 5.4 继代培养 将诱导出的不定芽取出，接种于 B5+KT 0.5mg/L～0.8 mg/L+ NAA 0.05 mg/L～0.1 mg/L 继代增殖 培养基上，30 d 后基础苗分裂的成熟细胞转变为具有分裂能力的细胞生长出健壮、茂密、叶色正绿带 有 2 片叶子的无根小苗。需要大量生产时，可重复此过程。 5.5 生根培养 将继代培养中带有叶尖的不定芽，分成单株转入培养基 B5＋IBA 0.1mg/L 中进行生根培养，附加食 用白砂糖 25 g/L～35 g/L，卡拉胶 3 g/L～5 g/L，7d 后约 85 %的基础苗生根，根系发达，生长势表现 良好。 5.6 炼苗 当根长约 1 cm，且具有两条以上根系时，将组培苗移入温度为 20 ℃～25 ℃，湿度为 80 %的环境 中炼苗 16 d。闭瓶苗移到光照为 2000 Lx 的自然光下照射 6 d，再除去封口材料炼苗 10 d。 5.7 移栽 炼苗后洗净根部残留的培养基，移入栽培基质中，基质配比为蛭石+珍珠岩（3:2），缓苗期间控制 适宜温湿度，勿积水。 3 DB15/T 1610—2019 AA 附 录 A （资料性附录） B5 基础培养基成分 表A.1 B5 基础培养基成分 使用浓度 成分 mg/L 大量元素 (NH4)2SO4 134 KNO3 2500 CaCl2H2O 150 MgSO47H2O 250 NaH2PO4 150 微量元素 KI 0.75 H3BO3 3.0 MnSO44H2O 10 ZnSO47H2O 2.0 Na2MoO42H2O 0.25 CuSO45H2O 0.025 CoCl26H2O 0.025 铁盐 FeSO47H2O 27.8 Na2EDTA2H2O 37.3 有机成分 肌醇 100 烟酸 1.0 盐酸吡哆醇 1.0 烟酸硫胺 10 谷氨酰胺 800 _________________________________ 4