(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111671932.5 (22)申请日 2021.12.31 (71)申请人 海南大学 地址 570100 海南省海口市美兰区人民大 道58号 (72)发明人 缪卫国　徐鑫泽　施泽坤　刘文波　 李潇　林春花　 (74)专利代理 机构 海南汉普知识产权代理有限 公司 46003 代理人 刘建芳 (51)Int.Cl. G01N 21/65(2006.01) G06K 9/62(2022.01) (54)发明名称 一种白粉菌分生孢子快速鉴别方法 (57)摘要 本发明提供一种白粉菌分生孢子快速鉴别 方法， 包括： 收集分生孢子、 拉曼光谱测量、 数据 处理、 聚类分析和鉴别五个步骤， 操作 简便， 所需 的时间少， 在测量时激发波长产生的基底信号更 小， 背景信号干扰小， 对于白粉菌等难以培养的 专性寄生菌来说具有极大的优势， 在单孢子水平 上实现白粉菌的快速鉴别， 而且本发 明鉴定方法 对样品的需求量极小， 不怕样品污染的存在和其 他信号的干扰， 为农作物白粉菌病害的防控提供 了有力的支持。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 114324296 A 2022.04.12 CN 114324296 A 1.一种白粉菌分生孢子快速鉴别方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1.植物病原真菌分生孢子的收集； S2.分生孢子拉曼光谱测量： 将步骤S1收集到的样品进行拉曼光谱测量， 收集每个分生 孢子的拉曼光谱； S3.数据处理： 校正和标准化步骤S2收集到的拉曼光谱原始信息， 得平均拉曼光谱曲 线； 计算所有范围的每个波数对应拉曼强度的标准偏差， 并在平均光谱曲线上以阴影区域 表示， 得到平均拉曼光谱图； S4.聚类分析： 基于步骤S3校正和标准 化后的信息进行聚类分析； S5.鉴别： 观察步骤S3的拉曼光谱图中是否存在白粉菌的特征峰， 然后根据步骤S4的聚 类分析结果判断种属。 2.根据权利要求1所述的白粉菌分生孢子快速鉴别方法， 其特征在于， 所述分生孢子的 收集方法， 包括： 孢子的培 养方法和/或采集方法。 3.根据权利要求1所述的白粉菌分生孢子快速鉴别方法， 其特征在于， 所述拉曼光谱测 量的激发光源为514nm， 激光功率为5mW， 光斑直径为1μm， 收集时间为10s， 光谱测量范围为 600cm‑1～2000cm‑1， 分辨率为1cm‑1。 4.根据权利要求1所述的白粉菌分生孢子快速鉴别方法， 其特征在于， 步骤S3中， 校正 和标准化包括减去单晶硅背景、 平 滑曲线、 基线校正和刻度归一 化。 5.根据权利要求1所述的白粉菌分生孢子快速鉴别方法， 其特征在于， 所述聚类分析为 主成分分析。 6.根据权利要求1所述的白粉菌分生孢子快速鉴别方法， 其特征在于， 步骤S5中， 白粉 菌的特征峰为10 05cm‑1， 1156cm‑1， 1518cm‑1。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114324296 A 2一种白粉菌分生孢 子快速鉴别方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 农业生物技术领域， 特别涉及一种白粉菌分生孢子快速鉴别方法。 背景技术 [0002]随着微生物学和分子生物学的快速发展， 植物病原真菌鉴定领域取得了巨大进 展， 主要包括传统诊断和分子鉴定方法的快速发展。 植物病原菌(真菌)鉴定通常基于感病 症状以及病原的形态学如菌核或菌丝体、 孢子形态和产 孢结构， 过程较为复杂， 且需要深厚 的微生物或病原学基础知识。 为提高微生物或者病原菌鉴定效率， 研究者们已经报道了利 用分子特征以及脂肪酸等鉴定病原菌， 但这些方法均受到提取方法以及条件等限制， 人们 仍然力图开发更加高效的微 生物或者病原菌鉴定手段。 [0003]拉曼技术作为指纹图谱具有其独特的优势， 蕴含着被测物独特的拉曼散射信号。 基于微生物或病原菌的生化特征， 每一种病原菌均可能具有特有的拉曼光谱特征。 拉曼光 谱是一种基于非弹性散射的技术， 其优点众多。 首先， 拉曼光谱对样品数量的要求极小， 可 以低至毫克或微克 的数量级。 其次， 拉曼效应存在的范围广泛， 气态、 液态和固态的分子都 可以被检测。 除了这些特点以外， 拉曼散射最突出的优点来源于其使用的探针分子为光子， 光子对于待测样品是无损的， 这种无损伤的检测格外适用于稀有 珍贵的检测对象和活体的 生物样本 。 [0004]目前， 已有应用拉曼技术区分微生物的研究报道， 例如， 在种、 变种与亚种水平上 区分不同的细菌； 利用光镊和拉曼光谱区分水溶液中单个细菌细胞和物种； 通过基于SERS 的微流控芯片实现9个不同的大肠杆菌在菌株上的区分； 利用SERS作为探测细菌生化成分 的工具等。 现有大多数有关拉曼技术主要针对医学领域与模式细菌微生物的探索， 以真菌 为样本的研究报道相对较少。 [0005]与细菌相比， 真菌孢子在微观层面上相比于细菌细胞更大， 真菌孢子具有更复杂 的结构， 例如具有细胞壁， 细胞核以及其他细胞器， 这些细胞结构的组成成分均会对拉曼散 射产生一定的影响， 复杂的细胞结构导致了更多的拉曼散射信号， 这就对利用拉曼聚焦真 菌及其信号收集提出了更高的要求。 因此， 真菌的拉曼研究， 无论在样品制备、 信号采集， 还 是峰值分析 方面， 均不能照搬细菌拉曼研究方法。 [0006]在运用拉曼光谱针对真菌的研究上， 有报道拉曼技术对人类致病真菌犬小孢子 菌、 癣菌等进 行种水平上区分， 还有报道拉曼技术用于食品方面曲霉等微生物的鉴定， 在植 物病原真菌领域， 已有报道利用拉曼技术对担子菌以及造成苹果腐烂的青霉、 曲霉以及链 格孢等真菌进行成分分析或种类鉴定， 验证了SERS有潜力成为一种廉价、 快速的检测和鉴 定真菌种类的方法。 但植物病原真菌包含着专性寄生真菌和非专性寄生真菌两大类， 因为 专性寄生真菌在合成培养基上无法培养， 对其鉴定面临着种水平上致病症状以及分生孢子 极其相似、 无法纯分离培养、 样本难以富集以及形态相似难以区分等难题， 所以现有研究都 集中在拉曼技术在非专 性寄生真菌中的应用， 目前尚未见拉曼技术应用于专 性寄生真菌的 研究报道。说　明　书 1/4 页 3 CN 114324296 A 3