(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111661714.3 (22)申请日 2021.12.3 0 (71)申请人 华南理工大 学 地址 510640 广东省广州市天河区五山路 381号 (72)发明人 任娇艳　徐天雄　姚茂金　黄楚君　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 林奕聪 (51)Int.Cl. C12N 5/078(2010.01) C12N 5/09(2010.01) C12Q 1/02(2006.01) A61K 31/715(2006.01) A61P 35/00(2006.01)A61P 37/04(2006.01) (54)发明名称 MC38-N4/OT-I共培养系统筛选方法及其筛 选的多糖组方与多糖组合物的应用 (57)摘要 本发明公开了MC38 ‑N4/OT‑I共培养系统筛 选方法及其筛选的多糖组方与多糖组合物的应 用。 基于该筛选方法得到多糖组合物的步骤包 括： 获得含特异性抗原和荧光蛋白的肿瘤靶细 胞、 分离免疫效应细胞、 共培养肿瘤靶细胞与免 疫效应细胞、 评价多糖组方的免疫调节功能。 本 发明提供的共培养筛选方法， 其优点在于： 基于 肿瘤微环境的特点模拟了肿瘤细胞和与免疫细 胞的相互作用过程， 兼具应用范围广、 实验结果 可视化、 高通量筛选等特点。 本发明提供的多糖 组合物， 其原料包括姬松茸、 灰树花和陈皮， 该组 方具有改善机体免疫功能、 增强抗肿瘤功效等， 可用于免疫增强相关产品的开发， 为食源性多糖 组方应用于临床免疫增强药物提供实验基础和 科学依据。 权利要求书1页 说明书8页 附图4页 CN 114350604 A 2022.04.15 CN 114350604 A 1.MC38‑N4/OT‑I共培养系统筛选方法， 其特征在于， 所述MC38 ‑N4/OT‑I共培养系统筛 选方法包括如下步骤： (1)用含特异性抗原及荧光蛋白的重组质粒转染肿瘤靶细胞， 转染后加入抗生素筛选， 持续药筛后， 荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况； 经过单克隆扩培、 流式细胞分选， 得 到表达特异性 抗原的可视化肿瘤靶细胞； (2)分离小鼠免疫脏器组织， 研磨以及裂解红细胞后， 获得免疫效应细胞的单细胞悬 液； (3)肿瘤靶细胞铺板贴壁后， 加入免疫效应细胞， 同时加入待筛 选物， 进行共培 养。 2.根据权利要求1所述MC38 ‑N4/OT‑I共培养系统筛选方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所 述含特异性抗原及荧光蛋 白的重组质粒为pLVX ‑IRES‑tdTomato ‑N4重组质粒； 所述肿瘤靶 细胞包括： LLC小鼠肺癌细胞、 MC38小鼠结肠癌细胞、 B 16小鼠黑色素瘤细胞或GL261小鼠胶 质母细胞瘤细胞中的一种以上； 所述抗生素包括嘌呤霉素、 青霉素或链霉素中的一种以上； 所述抗生素的浓度为1 ‑10 μg/mL； 所述药筛的时间为 4‑15天。 3.根据权利要求1所述MC38 ‑N4/OT‑I共培养系统筛选方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所 述小鼠包括OT ‑I或OT‑II小鼠； 所述脏器包括脾脏、 胸腺或淋巴结中的一种以上； 所述免疫 效应细胞为OT ‑I全脾脏免疫效应细胞。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述MC38 ‑N4/OT‑I共培养系统筛选方法， 其特征在于， 步骤 (3)所述免疫效应细胞与肿瘤靶细胞的细胞个数比例为(100 ‑1)： 1， 步骤(3)所述共培养的 时间为12 ‑96h。 5.权利要求4所述MC38 ‑N4/OT‑I共培养系统筛选方法筛选的多糖组方， 其特征在于， 所 述多糖组方组成原料包括有： 姬松 茸、 灰树花、 陈皮、 桑黄、 灵芝、 茯苓、 当归和枸杞中的一种 以上， 所述多糖组方为姬松 茸多糖、 灰树花多糖、 陈皮多糖、 桑黄多糖、 灵芝多糖、 茯苓多糖、 当归多糖和枸杞多糖中的一种以上， 所述多糖组方的免疫调节功能筛选评价包括： (1)肿瘤 细胞与免疫细胞共培养后， 胰酶消 化， 混合细胞收集于流式管中， 离心后重悬细胞， 检测肿 瘤靶细胞的数量， 根据肿 瘤靶细胞的死亡率筛选得到多糖组合物； (2)使用Cytation7高通 量活细胞成像系统对共培养细胞进行高通量荧光成像筛选， 根据肿瘤细胞荧光数量的变化 筛选得到多糖组合物。 6.根据权利要求5所述MC38 ‑N4/OT‑I共培养系统筛选方法筛选的多糖组方， 其特征在 于， 所述多糖组方中的姬松茸多糖、 灰树花多糖、 陈皮多糖和桑黄多糖的质量份数比为(1 ‑ 125)份： (1 ‑125)份： (1 ‑25)份： (0 ‑25)份。 7.根据权利要求5所述MC38 ‑N4/OT‑I共培养系统筛选方法筛选的多糖组方， 其特征在 于， 所述使用C ytation7高通量活细胞成像系统对共培养细胞进行高通量荧光 成像筛选， 用 于筛选和评价具有免疫调节活性的物质； 所述检测通过荧 光成像可视化。 8.权利要 求5所述多糖组合物的应用， 其特征在于， 所述多糖组合物在制备增强CD8+T细 胞抗肿瘤免疫记 忆作用、 增强机体免疫活性以及促进抗肿瘤功效的药物中的应用。 9.根据权利要求8所述多糖组合物的应用， 其特征在于， 所述增强机体免疫活性主要在 于提高CD 8+T细胞的存活率以及CD 8+CD62L的比例。 10.根据权利要求8所述多糖组合物的应用， 其特征在于， 所述促进抗肿瘤功效主要在 于提高免疫细胞对 含特异性 抗原的肿瘤 细胞的杀伤效果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350604 A 2MC38‑N4/OT‑I共培养系统筛选方 法及其筛选的多糖组方与多 糖组合物的应用 技术领域 [0001]本发明属于功能食品技术领域， 具体涉及 MC38‑N4/OT‑I共培养系统筛选方法及其 筛选的多糖组方与多糖组合物的应用。 背景技术 [0002]肿瘤的发生、 生长及转移与肿瘤细胞所处的内外环境密切相关。 肿瘤微环境 (Tumor micro‑envirnment， TME)是指肿瘤细胞存在的周围微环境， 包括周围的血管、 免疫 细胞、 成纤维细胞、 骨髓源性细胞、 各种信号分子和细胞外基质。 近年来， 免疫疗法由于能有 效刺激宿主免疫系统， 促进肿瘤微环境中免疫细胞杀死癌细胞， 因此在癌症治疗中已经发 展成为继手术、 化疗、 放疗之后的第四种抗肿瘤治疗手段。 研究发现， 天然多糖具有较强的 预防肿瘤发生和抑制肿瘤的作用， 且与传统的肿瘤治疗方法相比， 天然多糖具有低毒和调 节免疫的优点。 食源性天然多糖不仅对大多数机体细胞都没有明显毒性， 并且能刺激各种 免疫活性细胞的增殖、 分化和成熟， 使机体的免疫系统得到恢复和增强， 从而被公认为是一 种重要的生物效应调节剂 。 因此寻找可以长期食用且副作用较小的食源性活性多糖对于肿 瘤患者来说具有重大意 义。 [0003]目前筛选免疫调节活性物质的动 物模型主要包括： 异种移植模型、 同源移植模型、 基因敲除模型、 基因工程小鼠模 型和人源基因敲入模型等。 相比于动物模型， 体外细胞模型 具有实验周期短、 筛选通量高等优点。 体外筛选免疫调节活性物质的模型主要有RAW264.7 细胞极化模型、 2D共培养模 型、 类器官和微流控细胞模型等。 理想的多糖筛选体外试验应较 为接近地模拟体内的肿瘤微环境， 以高灵敏度和特异性进行免疫治疗的高通量筛选， 以便 对预期有效药物进 行进一步试验。 RA W264.7细胞极化方法无法真实模拟肿瘤微环 境中细胞 之间复杂的相互作用过程； 类器官模型虽广泛用于癌症活检组织培养， 但通常也只包含肿 瘤细胞而不包含免疫细胞。 与单细胞体外筛选模型相比， 共培养细胞模型是更复杂、 更具生 物相关性和预测性的细胞筛选法， 共培养模型 因能更好地模拟体内环境和对药物治疗的反 应， 所以更适用于化合物的筛选。 基于肿瘤微环 境的多细胞的性质， 肿瘤细胞和免疫细胞共 培养模型能模拟肿瘤微环境中细胞间的相互作用， 可用于体外测试免疫疗法以及免疫制剂 的功效。 [0004]目前也需要开发更有效的体外细胞毒性检测方法， 通过量化肿瘤微环境中的免疫 细胞对肿瘤细胞的杀伤作用， 评估筛选物在肿瘤微环境中的免疫调节功效。 其中，51Cr释放 试验是最常见的体外检测方法， 通常被用于测量T细胞介导的细胞毒性作用， 但该实验具有 放射性毒性， 应用受到限制。 Pimentel等研究提出利用萤火虫荧光素酶试验评估肿 瘤细胞 的靶向杀伤死亡率， 该方法实验过程繁琐， 不仅需要加反应底物， 而且由于反应时间短需要 快速检测， 实验结果不能可视化， 因此难以满足实验大规模筛选的需求(Olivo  Pimentel   V,Yaromina  A,Marcus  D,Dubois  LJ,Lambin  P.A novel co‑culture assay to assess  anti‑tumor CD8+T cell cytotoxicity  via luminescence  and multicolor  flow 说　明　书 1/8 页 3 CN 114350604 A 3