(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111580676.9 (22)申请日 2021.12.2 2 (71)申请人 北京世纪沃德生物科技有限公司 地址 102200 北京市昌平区科技园区火炬 街21号4幢4层401 (72)发明人 郝立颖　彭勇　韩豪杰　彭悦蕾　 曹培杰　 (74)专利代理 机构 北京奇眸智达知识产权代理 有限公司 1 1861 代理人 吴小平 (51)Int.Cl. C07K 16/18(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A61K 39/395(2006.01)A61P 35/00(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/543(2006.01) (54)发明名称 一种CRP驼源单域 抗体及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种CRP驼源 单域抗体及其制 备方法和应用， 涉及生物医药领域， 通过免疫CRP 抗原的羊驼白细胞进行富集， 然后进行单细胞筛 选、 测序。 通过测序结构分析， 构建驼源CRP抗体 重组质粒， 克隆转化真核细胞中表达相关抗体， 筛选得到具有人CRP抗性的单抗， 对所述单抗的 VHH结构域进行克隆表达， 通过配对筛选得到具 有抗体活性的CRP ‑VHH的单抗。 该抗体能够应用 在ELISA试剂盒、 化学发光试剂盒、 胶乳试剂盒， 且具有和现有的试剂盒同等功能， 同时该抗体仍 具有在制备抗肿瘤药物上的用途。 权利要求书1页 说明书11页 序列表4页 附图2页 CN 114195891 A 2022.03.18 CN 114195891 A 1.一种CRP驼源单域抗体， 其特征在于， 包括框架区和可变区， 所述可变区具有第一可 变区、 第二可变区以及第三可变区； 第一可变区为 抗体氨基酸序列上的第28 ‑35位氨基酸区域； 第二可变区为 抗体氨基酸序列上的第52 ‑58位氨基酸区域； 第三可变区为 抗体氨基酸序列上的第96 ‑108位氨基酸区域。 2.根据权利要求1所述的一种CRP驼源单域抗体， 其特征在于， 与可变区至少具有80％ 的同源性。 3.根据权利要求1所述的一种CRP驼源单， 其特征在于， 与框架区具有至少60％的同源 性。 4.根据权利要求1所述的一种CRP驼源单域抗体， 其特征在于， 其氨基酸序列如下列氨 基酸序列之一； SEQ ID NO： 2所示， 第一可变区为其上的第28 ‑35位氨基酸区域， 第二可变区为其上的 第52‑58位氨基酸区域， 第三可变区为 其上的第96 ‑108位氨基酸区域； SEQ ID NO： 15所示， 第一可变区为其上的第28 ‑34位氨基酸区域， 第二可变区为其上的 第52‑58位氨基酸区域， 第三可变区为 其上的第97 ‑106位氨基酸区域； SEQ ID NO： 33所示， 第一可变区为其上的第28 ‑34位氨基酸区域， 第二可变区为其上的 第52‑58位氨基酸区域， 第三可变区为 其上的第97 ‑106位氨基酸区域； SEQ ID NO： 36所示， 第一可变区为其上的第28 ‑34位氨基酸区域， 第二可变区为其上的 第52‑58位氨基酸区域， 第三可变区为 其上的第97 ‑106位氨基酸区域； SEQ ID NO： 68所示， 第一可变区为其上的第28 ‑34位氨基酸区域， 第二可变区为其上的 第52‑58位氨基酸区域， 第三可变区为 其上的第97 ‑105位氨基酸区域； SEQ ID NO： 81所示， 第一可变区为其上的第28 ‑34位氨基酸区域， 第二可变区为其上的 第52‑58位氨基酸区域， 第三可变区为 其上的第97 ‑106位氨基酸区域。 5.一种CRP驼源单域抗体的制备方法， 其特征在于， 通过免疫CRP抗原的羊驼白细胞进 行富集， 然后进行单细胞筛选、 测序， 通过测序结构分析， 构建驼源CRP抗体重组质粒， 克隆 转化真核细胞中表达相关抗体， 筛选得到具有人CRP抗性的单抗， 对所述单抗的VHH结构域 进行克隆表达， 通过配对筛 选得到。 6.一种ELISA试剂盒， 其特征在于， 包含如权利 要求1‑4任意一项所述的CRP驼源单域抗 体或如权利要求6所述的制备 方法制得的CRP驼源单域 抗体。 7.一种化学发光试剂盒， 其特征在于， 包含如权利要求1 ‑4任意一项所述的CRP驼源单 域抗体或如权利要求5所述的制备 方法制得的CRP驼源单域 抗体。 8.一种胶乳试剂盒， 其特征在于， 包含如权利要求1 ‑4任意一项所述的CRP驼源单域抗 体或如权利要求5所述的制备 方法制得的CRP驼源单域 抗体。 9.如权利要求1 ‑4任意一项所述的CRP驼源单域抗体或如权利要求5所述的制备方法制 得的CRP驼源单域 抗体在制备抗肿瘤药物上的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114195891 A 2一种CRP驼源单域抗体及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物医药 领域， 具体讲 是一种CRP驼源单域 抗体及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]免疫球蛋白(Immunoglobulin， Ig)， 一种具有抗体活性或者化学结构和抗体分子 相似的球蛋白。 抗血清能与相关抗原免疫 结合， 根本原因为抗血清中存在免疫球蛋白， 它是 免疫细胞的产 物(单克隆抗体除外)， 另外， 此物质也分布在机体的体液、 外 分泌液和淋巴细 胞的膜上。 免疫球蛋白有多种成分， 主要是IgG， 占总体的70％左右， 约为7 ‑16g/L。 哺乳动物 的Ig分子呈对称型结构， 都是由4条肽链组成， 肽链间以二硫键链接。 如图1所示， 其中重链 (Heavy chain， H链)为两条长链， 轻链(Light  chain， L链)为两条短链， 链间二硫键将4条链 构成经典的Y型。 无论是重链或轻链， 第一个结构域的氨基酸序列均具有多样性， 称为免疫 球蛋白分子识别抗原的可变区(var iable region)。 可变区之后是序列相对固定的区域， 称 为恒定区(constsant  region)， 除铰链区外， 每个结构域约由110个氨基酸残基组成并都有 其独特的功能。 免疫球蛋白的可变区包括四个为结构域提供骨架结构， 维持空间结构的稳 定的骨架区(framework  region,FR)和介于它们之间的三个与抗原表面形成互补关系的互 补决定区(co mplementary  determining  region,CDR)。 CDR区的氨 基酸序列差异性非常大， 又被称为高变区(hypervariable  regions)。 与可变区相比， 恒定区序列在种内较为保守VH 和VL内各有4个骨架区， 分别以FR 1、 FR2、 FR3和FR4表示。 [0003]1993年， Hammers等人在骆驼外周血淋巴细胞中分离出一种结构不同于传统抗体 的重链抗体， 该抗体天然缺失轻链还有重链可变区CH1， 通过将此抗体的可变区进行PCR扩 增， 即可得到一抗体片段， 称单域抗体。 此单域抗体的分子量仅有约15kDa， 传统常规抗体分 子量一般为155kDa左右， 因单域抗体分子量只有其分子量的1/10左右， 故又称单域抗体为 纳米抗体(VHH,variable  domain of heavy chain of heavy 2chainantibody)。 即使该抗 体仅含有重链， 但是其仍具有完整的抗原结合性能。 VHH抗体不但具有完整的抗原亲和性， 同时还具有诸多的优点， 例如VHH抗体CDR3区有一个暴露地大凸环(由二硫键 保持稳定)， 可 深入到抗原的裂隙或空腔 中， 使VHH抗体与抗原结合能力增强， 该抗体具备分子量小、 容易 获得和表达、 高水溶性和稳定性、 靶向性和人源性简单等优点。 VHH抗体作为研究工具载体、 疾病诊断工具和疾病治疗策略等方面具有很好的应用前 景。 [0004]C‑反应蛋白(CRP)是机体在炎症、 感染或损伤时产生的一种急性期反应蛋白， 当其 升高时提示机体发生炎症反应。 人CRP发挥重要的功能， 例如参与宿主防御、 抗原清除和代 谢等， 都需要通过其与一系列外生或自体因子的相互作用。 C反应蛋白可以与DNA和组蛋白 相互作用， 它可以清除受损循环细胞释放的核物质。 除以上功能和效应外， CRP同时还具有 致病效应。 例如CRP浓度的升高被证明与冠状动脉粥样硬化疾病密切相关。 CRP不仅是动脉 粥样硬化疾病的标志物， 更可能直接参与其形成， CRP与氧化的LDL(低密度脂蛋白)结合加 剧冠状动脉梗塞中的组织损伤， 并抑制受损血 管内皮的修复。说　明　书 1/11 页 3 CN 114195891 A 3