(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111598473.2 (22)申请日 2021.12.24 (71)申请人 中国石油大 学 （华东） 地址 266580 山东省青岛市黄岛区长江西 路66号 申请人 安丘市增塑剂厂 (72)发明人 张志庆　徐东彦　王芳　杨春天　 姜贤红　 (74)专利代理 机构 北京金信知识产权代理有限 公司 11225 代理人 徐琳　张皓 (51)Int.Cl. A61K 47/54(2017.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 31/713(2006.01)A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) (54)发明名称 一种DNA纳米载体复合物及其制备方法和应 用 (57)摘要 本发明提供了一种DNA纳米载体复合物及其 制备方法和应用。 所述DNA纳米载体复合物包括 DNA靶向载体、 抗癌药物和治疗基因， 其中， 所述 DNA靶向载体包括具有a个串联的重复单元的长 单链DNA、 a条适配体链、 a条锚定链和a条互补DNA 单链， 其中， a为2 0～300的整数， 以及， 其中， 所述 长单链DNA的每个重复单元由串联的三个部分序 列组成， 所述适配体链通过在适配体末端延长的 未配对碱基通过互补配对与所述串联的三个部 分序列中的一个连接， 所述锚定链用于连接治疗 基因并利用碱基互补配对与所述串联的三个部 分序列中的另一个连接， 所述互补DNA单链利用 碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的 最后一个连接 。 权利要求书2页 说明书10页 序列表4页 附图2页 CN 114246951 A 2022.03.29 CN 114246951 A 1.一种DNA纳米载体复合物， 包括DNA靶向载体、 抗癌药物和治疗基因， 其中， 所述DNA靶向载体包括具有a个串联的重复单元的长单链DNA、 a条适配体链、 a条 锚定链和a条互补DNA单链， 其中， a为20～300的整数， 优选地， a为50～100的整数， 以及， 其 中， 所述长单链DNA的每个重复单元由串 联的三个部 分序列组成， 所述适配体链通过在适配 体末端延 长的未配对碱基通过互补配对与所述串联的三个部分序列中的一个连接， 所述锚 定链用于连接治疗基因并利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的另一个连接， 所述互补DNA单链利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的最后一个连接 。 2.根据权利要求1所述的DNA纳米载体复合物， 其中， 所述具有a个串联的重复单元的长 单链DNA是基于滚环扩增的长单链DNA分子， 优选地， 所述具有a个串 联的重复单元的长单链 DNA的长度为4000bp ‑19000bp， 更优选约8000bp， 还更优选地， 所述具有a个串联的重复单元 的长单链DNA具有约127个串联的6 3碱基重复序列。 3.根据权利要求1所述的DNA纳米载体复合物， 其中， 所述适配体链包括能够特异性识 别癌细胞的适配体， 并通过在适配体末端延长的未配对碱基与DNA长单链上碱基互补配对 连接， 优选地， 所述适配体为选自以下各项中的一种或多种： AS1411(核仁蛋白特异核酸适 配体)、 人源性肝癌细胞(HepG2)的适配体HA09、 白血病细胞(CEM)的适配体Sgc8， 更优选地， 所述适配体5’端标记荧 光基团。 4.根据权利 要求1所述的DNA纳米载体复合物， 其中， 所述治疗基因包括抑制致病性RNA 活性的小干扰RNA(si RNA)、 编码治疗性蛋白的基因或编码疫苗抗原的基因， 优选地， 所述治 疗基因为选自以下各项中的一种或多种： 信号转导子和转录激活子3小干扰RNA(STAT3   siRNA)、 再生肝磷酸酶 ‑3小干扰RNA(PRL ‑3 siRNA)、 结肠癌转移相关基因1小干扰RNA (MACC1 siRNA)， 其中优选STAT3  siRNA。 5.根据权利 要求1所述的DNA纳米载体复合物， 其中， 所述长单链DNA的重复单元具有如 SEQ ID NO:3所示的序列； 所述锚定链具有如SEQ  ID NO:4所示的序列； 所述互补DNA单链具 有如SEQ ID NO:6所示的序列； 所述适配体链选自以下一种或多种： SEQ  ID NO:5、 SEQ  ID  NO:9、 SEQ  ID NO:12； 所述治疗基因选自以下一种或多种： STAT3  siRNA、 PRL ‑3 siRNA、 MACC1 siRNA， 优选地， 所述治疗基因为STAT3  siRNA， 其正义链如SEQ  ID NO:7所示， 以及反 义链如SEQ  ID NO:8所示。 6.根据权利要求1所述的DNA纳米载体复合物， 其中， 所述抗癌药物为化疗药物， 优选选 自以下各项中的一种或多种： 盐酸阿霉素(Dox)、 佛波酯(PMA)、 紫杉醇， 更优选Dox。 7.权利要求1 ‑6中任一项所述的DNA纳米载体复合物的制备方法， 所述制备方法包括以 下步骤： (1)滚环扩增合成长单链DNA： 采用DNA环状模板与引 物， 在聚合酶和缓冲液作用下， 于 10～80℃温度中聚合1～30min后升至40～120℃终止， 所得溶液冷却至室温制得长单链 DNA； (2)DNA靶向载体 的组装： 将长单链DNA与互补DNA单链、 适配体链、 锚定链杂交， 并和退 火缓冲液混合， 在25～170℃热处理后在PCR仪中以1℃/min的速度冷却， 10～40℃恒温过夜 组装， 其中DNA靶向载体与互补DNA单链、 适配体链、 锚定链加入的浓度比分别为1:10～1: 300； (3)向载体对抗癌药物和治疗基因的双负载： 将上述所得DNA靶向载体与抗癌药物于室权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114246951 A 2温孵育20～50min， 再加入治疗基因， 20～100℃隔夜退火得到双负载体系， 其中： 治疗基因 与DNA靶向载体浓度比为1： 3 0～90。 8.根据权利要求7的所述制备方法， 其中， 所述的聚合酶为用于生物催化合成脱氧核糖 核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的聚合酶， 优选为选自以下各项中的一种或多种： Phi29聚合 酶、 Pwo聚合酶、 Vent  DNA聚合酶等， 其中优选Phi2 9聚合酶。 9.权利要求1 ‑6中任一项所述的DNA纳米载体复合物在制备用于治疗癌症 的药物中应 用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其中， 所述癌症包括选自以下各项中的一种或多种： 黑 色素瘤、 肝癌、 乳腺癌， 其中优选黑色素瘤。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114246951 A 3