(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111644136.2 (22)申请日 2021.12.3 0 (71)申请人 上海纳米技 术及应用国家工程研究 中心有限公司 地址 201109 上海市闵行区剑川路468号 (72)发明人 崔大祥　朱君　朱竞尧　徐艳　 杨迪诚　 (74)专利代理 机构 上海东亚专利商标代理有限 公司 31208 代理人 董梅 (51)Int.Cl. A61K 9/51(2006.01) A61K 31/713(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 47/42(2017.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种EV装载CPP-siRNA纳米颗 粒的制备方法 及其产品和应用 (57)摘要 本发明属于生物大分子和细胞生物学领域， 提供了一种EV装载CPP ‑siRNA纳米颗 粒的制备方 法及其产品和应用。 该方法包括： 将EV分散在葡 萄糖溶液中制备含有EV 的葡萄糖溶液； 在CPP溶 液中加入葡萄糖， 在siRNA溶液中加入葡萄糖， 按 照摩尔比为1 ‑50： 1将CPP溶液与siRNA溶液混合， 然后纯化得到CPP ‑siRNA纳米颗粒； 混合含有EV 的葡萄糖溶液和含有CPP ‑siRNA的溶液， 孵育后 再实施分离得到装载有CPP ‑siRNA纳米颗粒的 EV。 本发明能够得到纳米级的CPP ‑siRNA颗粒， 可 以用于EV靶向修复， 提高EV的靶向效率和EV的细 胞摄取效率； 本发明制备过程简单、 反应易控制、 稳定性好、 可产业 化。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 CN 114306278 A 2022.04.12 CN 114306278 A 1.一种装载siRNA的纳米颗粒的制备 方法， 其特 征在于， 制备 过程包括以下步骤： （1） 将EV分散在葡萄糖溶 液中， 制备 得到浓度为108‑1012个/mL的溶 液； （2） 获得浓度为0.8mmol/L ‑1.2mmol/L的CPP溶液， 加入葡萄糖并调节葡萄糖的浓度为 3%‑8%； 将siRNA溶解， 制备得到浓度为45 μmol/L ‑55 μmol/L的溶液后， 加入葡萄糖， 并调节葡 萄糖的浓度为3% ‑8%； 按照CPP与siRNA摩尔比为1 ‑50： 1将CPP溶液与siRNA溶液混合， 然后纯 化， 得到CPP‑siRNA纳米颗粒； （3） 将步骤 （1） 和步骤 （2） 按照EV与siRNA的摩尔比为1： 1000 ‑30000混合 并孵育， 再实施 分离， 得到装载有CP P‑siRNA纳米颗粒的EV。 2.根据权利要求1所述的装载siRNA的纳米颗粒的制备方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中， 所述CPP ‑siRNA纳米颗粒中， CPP的序列选自以下序列中的一种： LLWRLWRLLWRLWRLL、 LLRLLRWWWRLLRLL、 KWLLRWLSRLLRWLARWLG和RLWRLLWRLWRRLWRLLR； 或者， 所述siRNA的义链序列为5 ’ ‑GGCUGGUUAUGUCCUCAUUdTdT ‑3’， 所述siRNA的反义链 序列为3’ ‑dTdTCCGACCAAUACAGGAGUAA‑5’。 3.根据权利要求1所述的装载siRNA的纳米颗粒的制备方法， 其特征在于， EV分散在葡 萄糖溶液中， 制备 得到浓度不低于1010个/mL的溶 液； 或者， 葡萄糖的浓度为3 ‑8%。 4.根据权利要求1所述的装载siRNA的纳米颗粒的制备方法， 其特征在于， 骤 （3） 中， 所 述孵育的温度为3 0℃‑50℃， 或者孵 育的时间为1h ‑5h。 5.根据权利要求1所述的装载siRNA的纳米颗粒的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 分离时采用密度梯度离心分离方法。 6.根据权利要求1所述的装载siRNA的纳米颗粒的制备 方法， 其特 征在于， 步骤 （1） 中， 将EV分散在葡萄糖溶液中， 调节葡萄糖的浓度为8%， 制备得到浓度为1010 个/mL的溶 液； 或者， 步骤 （2） 中， 将CPP溶解， 制备得到浓度为0.5  mmol/L的溶液， 然后加入葡萄糖， 并调节 葡萄糖的浓度为8%； 将siRNA溶解， 制备得到浓度为50  μmol/L的溶液， 然后加 入葡萄糖， 并 调节葡萄糖的浓度为8%； 将CPP溶液与siRNA溶液混合， 然后纯化， 得到CPP ‑siRNA纳米颗粒； 或者， 步骤 （3） 中， 将步骤 （1） 和步骤 （2） 按照EV与siRNA的摩尔比为1： 10000混合后孵育， 再实 施分离， 得到装载有CP P‑siRNA纳米颗粒的EV。 7.一种装载siRNA的纳米颗粒， 其特征在于， 所述的装载siRNA的纳米颗粒是EV装载 CPP‑siRNA纳米颗粒。 8.根据权利 要求7所述的装载siRNA的纳米颗粒， 其特征在于， 根据权利 要求1‑6中任意 一项所述的方法制备 得到。 9.权利要求7所述装载siRNA的纳米颗粒的应用， 其特征在于， 所述的装载siRNA的纳米 颗粒是EV装 载CPP‑siRNA纳米颗粒， 所述的应用是EV装 载CPP‑siRNA纳米颗粒在靶向修饰中 的应用。 10.根据权利 要求9所述的装载siRNA的纳米颗粒的应用， 其特征在于， 提 高EV的靶向效 率和EV的细胞摄取效率。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114306278 A 2一种EV装载CP P‑siRNA纳米颗粒的制备方 法及其产品和应用 技术领域 [0001]本发明属于生物大分子和细胞生物学领域， 涉及一种EV装载CPP ‑siRNA纳米颗粒 的制备方法及其产品和应用， 具体地说涉及密度梯度离心分离方法制备EV装载CPP ‑siRNA 纳米颗粒。 背景技术 [0002]RNA干扰 （RNA  interference， RNAi） 是由双链RNA诱发的基因沉默现象， 通过抑制 特定基因的翻译或转录来抑制特定蛋白的表达。 RNAi于1998年发现， 被 《Science》 评为2001 年十大科技突破之一。 2004年开展了第一个基于小干扰RNA （small  interfering  RNA， siRNA） 的临床实验， 2006年siRNA的临床转化研究获得了诺贝尔生理学奖。 由于RNAi机制参 与到了肿瘤的发生和发展进程， siRNA已经成为最有效的抗癌治疗策略之一， 并且siRNA药 物具有高特异性和低毒， 可以同时抑制多个基因靶点， 产生更强的抗肿瘤效。 然而， 到目前 为止， siRNA用于癌症的治疗 大部分仍处于基础研究， 尚未应用于临床， 主要障碍是si RNA的 递送问题。 由于siRNA在体内极易被RNA酶降解， 并且siRNA分子量较大， 且 带负电荷， 很难穿 过细胞膜进入细胞质发挥作用。 因此， 寻找合 适的siRNA载体极为重要。 [0003]现有的siRNA载体仍有不足。 病毒是一种天然的基因载体， 病毒载体在 基因治疗中 占主导地位， 一些经修饰的病毒载体已被批准用于治疗人类疾病。 然而， 病毒载体的主要缺 点是载货能力有限及其免疫原 性， 可引起致命的不良反应。 此外， 病毒 载体有可能导致恶性 肿瘤， 这与病毒插入的原癌基因表达有关。 其他传统非病毒载体 （包括高分子聚合物、 无机 纳米颗粒、 脂质体等） ， 转载效率低于病毒载体， 易引起免疫反应、 不容易穿越生物屏障等， 在临床应用中也受到限制。 [0004]细胞外囊泡 （extracellular  esicles， EV） 是一类具有磷脂双分子层结构的、 纳米 到微米级大小的膜囊泡的总称。 根据大小、 生物特征和形成过程的不同， EV主要分为外泌 体、 微囊泡和凋亡小体。 其中， 微囊泡和外泌体是由活细胞主动分泌， 可以传递mRNA、 miRNA 和蛋白质到受体细胞， 进 行细胞间通信， 影响受体细胞表型。 EV已经被证明在 多种生理和病 理过程中起着关键作用， 包括免疫应答、 新陈代谢与血管疾病、 肿瘤的发生与转移、 组织修 复和神经退行性疾病的进展。 由于EV是小RNA的天然 载体， 能够在细胞间进行小RNA递送， 并 且在体内免疫原性小、 能够跨越生物屏障等优势， 使其成为非常有潜力的siRNA载体候选。 但是， 他们的实际应用仍受到限制， 一方面缺乏EV高效装载siRNA的方法； 另一方面， EV体内 递送siRNA和基因沉默的效率尚未明确。 [0005]目前的EV装载方法有： （1） 基于转染的方法， 通过转染合适的表达载体诱导所选 siRNA在EV来源细胞的过表达或者直接转染所选siRNA到EV来源细胞， 分泌的EV可以负载选 定的siRNA。 然而， 缺点是转染试剂的残留可能会影响EV的封装过程和导致EV改性。 siRNA在 EV中的装载水平可能因不同的序列而存在较大差异。 （2） 被动的货物装载方法， 疏水性修饰 的siRNA与EV共孵育， 沿浓度梯度扩散到EV中。 该方法装 载效率低， 且不能排除siRNA是吸附 在EV膜表 面， 而没有进入EV内部的可能。 （3） 主动的货物装载方法， 主要包括超声和电穿孔。说　明　书 1/4 页 3 CN 114306278 A 3