(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111661624.4 (22)申请日 2021.12.3 0 (71)申请人 广州康盛生物科技股份有限公司 地址 510660 广东省广州市黄埔区高新 技 术产业开发区科 学城神舟街8号 (72)发明人 陈校园　李家萍　张海珍　杨睿祯　 陈思锐　杨正根　 (74)专利代理 机构 广州市诺 丰知识产权代理事 务所(普通 合伙) 44714 代理人 许飞 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/62(2006.01)A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61M 1/36(2006.01) (54)发明名称 一种MIC蛋白及ULBP蛋白二价纳米抗体及其 应用 (57)摘要 本发明公开了一种MIC蛋白及ULBP蛋白二价 纳米抗体及其应用。 发明人筛选得到了性能优异 的抗MIC蛋白和抗ULBP蛋白的纳米抗体。 通过将 二者偶联得到的二价纳米抗体， 偶联至固相载体 上得到的免疫吸附剂， 可以通过血液净化的方式 同时清除肿瘤患者血清中游离的可溶性MICA、 MICB和ULBP分子， 提高清除率， 减少免疫逃逸作 用， 增强NK细胞的靶向杀伤作用。 权利要求书1页 说明书8页 序列表8页 附图7页 CN 114316051 A 2022.04.12 CN 114316051 A 1.一种抗MIC蛋白的纳米抗体， 其特 征在于： 其CDR 1～CDR3的氨基酸序列如下： CDR1： SFDAW、 CDR2： SLS DYYNKSVYAD SVKG、 CDR3： GP DYFDERAY； 或 CDR1： AWSRY、 CDR2： GT TWDDTLKVYAD SVKG、 CDR3： WYGRTFDAYN； 或 CDR1： GMYAM、 CDR2： GNKYRTNP SVYADSVKG、 CDR3： GYDGRTFEAY； 或 CDR1： WMSAM、 CDR2： GMKYRT TPSVSADSWKY、 CDR3： DYDMGQTWEAY 。 2.根据权利要求1所述的抗MIC蛋白的纳米抗体， 其特征在于： 其FR1～FR4的氨基酸序 列如下： FR1： DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCVGSGFSFT； FR2： WYRQAPGKERELV A； FR3： RFTISKDN NKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCRR； FR4： WGQGTQVTVS S。 3.一种抗MIC蛋白和ULBP蛋白的二价纳米抗体， 由抗MIC蛋白纳米抗体和抗ULBP蛋白纳 米抗体通过 连接肽偶联 得到， 其特 征在于： 所述 抗MIC蛋白纳米抗体如权利要求1或2所述。 4.根据权利 要求3所述的二价纳米抗体， 其特征在于： 所述抗ULBP蛋白纳米抗体的CDR1 ～CDR3的氨基酸序列如下： CDR1： LVSGMG G、 CDR2： EIHWDWD DKRYNAPSLK、 CDR3： YLDLM ETPWYSVMDQY； 或 CDR1： LLTGMGV、 CDR2： FIHWDGD DKRYNAPGLK、 CDR3： YLDLM ETPWYSVM EQY； 或 CDR1： VPTGMVG、 CDR2： FIHWDWEDKRYNAP SLK、 CDR3： YLDLM ESPWYSVMDQY； 或 CDR1： LVTGMG G、 CDR2： AFHWDWD DKRYNAPSVK、 CDR3： YQDLM ETPWYSVMDQH 。 5.根据权利要求4所述的二价纳米抗体， 其特征在于： 所述抗ULBP蛋白纳米抗体的FR1 ～FR4的氨基酸序列如下： FR1： QVTLKESGPGI LQPSQTLSLTCSFSGFSLS； FR2： WIRQPSGKGLEWLA； FR3： RLTISKDTSN NQVFLKIASVDT TDTATYYCVR； FR4： WGQGTSVTVS S。 6.根据权利要求3～5任一项所述的二价纳米抗体， 其特征在于： 所述连接肽的氨基酸 序列为： (GlySer)n、 (Gly2Ser)n、 (Gly3Ser)n或(Gly4Ser)n， n=1～5 。 7.DNA序列， 其编码权利 要求1或2所述的抗MIC蛋白的纳米抗体或编码权利要求3～6任 一项所述的二 价纳米抗体。 8.一种免疫吸附剂， 包括固相载体， 其特征在于： 所述固相载体上偶联有权利要求1或2 所述的抗MIC蛋白的纳米抗体； 和/或权利要求3～6任一项所述的二 价纳米抗体。 9.一种血 液净化器械， 其特 征在于： 其包括权利要求8所述的免疫吸附剂。 10.根据权利要求9所述的血 液净化器械， 其特 征在于： 其用于结合 NKG2D配体。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114316051 A 2一种MIC蛋白及ULBP蛋白二 价纳米抗体及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种MIC蛋白及ULBP蛋白二价纳米抗体及其 应用。 背景技术 [0002]主要组织相容性复合体I  类分子链相关基因(major  histocompatibility   complex  class I chain‑related  gene, MIC) 定位于人类第6  条染色体短臂上 (6p21.3)， 是跨越MHC ‑I 类区域2Mb  长度的非经典HLA ‑I 类基因家族。 MIC  基因家族包括 MICA， MICB， MICC， MICD， MICE， MIC F 和MICG 7 个成员， 其中只有MICA、 MICB  为功能基因， 具 有编码、 转录和表达功能， 余者5个由于点突变和缺 失突变为假基因。 包括5个内含子和6  个 外显子， 外显子1  编码L 前导肽， 外显子2 ‑4 分别编码细胞外α 1、 α 2  和α 3 3个球状结构域， 外显子5 编码跨膜区(TM)， 外 显子6 编码胞质尾部结构。 [0003]MICA 基因编码的产物是一条含有383  个氨基酸、 相对分子质量为43kD a 的高度 糖基化的蛋白质分子。 MICA/B  高度多态性， MICA  有超过100种多态性， 而MICB  也超过33   种可识别等位基因 （hla.alleles.org/classo.html  2019） 。 MICB 含 3 个可变的胞外域， 1 个跨膜区域和  1个羧基尾端。 胞外区域也包括α 1、 α 2  和α 3 3个结构域。 虽然  MICA/B的基 因长度有一定差距， 但在二者起始密码子上游一段长度约  1500 bp 的区段中， 彼此约有 90%的同源性， 并且  MICA/B 在近端均含有1个热休克蛋白元件 （王健， 2018） 。 肿瘤患者的血 清中的sMICA是由于金属蛋白酶的细胞外表面部分被水解后引起膜MICA的脱落而形成 sMICA。 多种肿瘤细胞可利用基质金属蛋白酶(Matrix  metallo proteinases， MMPs)、 去整 合素‑金属蛋白酶(A  disin‑tegrin and metalloproteases， ADA Ms) 水解细胞表面MICA /B  蛋白分子生成  sMICA/B。 sMICA  能够破坏NK细胞介导的肿瘤杀伤作用。 有研究发现多发性 骨髓瘤患者中， sMICA可引起NKG2D下调和淋巴细胞毒性受损， 引起NKG2D的免疫抑制。 同时， MGUS （恶性单克隆丙种球蛋白病） 患者产生高滴度的抗 ‑MICA抗体拮抗sMICA的抑制作用， 刺 激恶性浆细胞的树突状细胞交叉递呈作用。 内源性的anti ‑MICA抗体及MICA的脱落是患者 由MGUS （Monoclonal  gammopathy  of undetermined  significance） 转为MM的主要原因。 作 者认为抗 ‑MICA抗体能够有 效重建免疫平衡和免疫监控 （Masahisa  Jinushi， 2008） 。 总之， sMICA 对NKG2D的免疫监视起到了抑制作用。 通过 吸附作用降低sMICA的含量， 有利于肿瘤 患者的恢复。 [0004]在人类中， NKG2D配体除了MICA和MICB外， 还有人类巨细胞病毒糖蛋白  UL‑16 结 合蛋白( UL‑16 binding protein， ULBP)  ， 又名RAET1蛋白， 包括六个不同的ULBPs蛋白 （ULBP1~6） ， 该配体蛋白也位于人类6号染色体上。 ULBP  分为表达于组织细胞膜上的m ‑ULBP (membrane  ULBP)和血液中游离的s ‑ULBP （soluble  ULBP） 。 有研究发现， 肿瘤患者血清中的 游离形式的s ‑ULBP 蛋白增多一方面是由于基质金属蛋白酶或磷脂酶  C 的溶蛋白性裂解 作用所致， 另一方面是通过溶酶体依赖的方式释放到胞外导致， 而游离  ULBP 蛋白能够结 合到自然杀伤细胞表面的  NKG2D 受体上， 通过影响自然杀伤细胞受体的功能而影响其杀说　明　书 1/8 页 3 CN 114316051 A 3