(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111646961.6 (22)申请日 2021.12.2 9 (71)申请人 内蒙古自治区人民医院 地址 010017 内蒙古自治区呼和浩特市赛 罕区昭乌达路20号 (72)发明人 俞兰　武洲英　霍雪　武婷　 冯宗琪　王敏　李凤　 (74)专利代理 机构 北京金智普华知识产权代理 有限公司 1 1401 代理人 皋吉甫 (51)Int.Cl. C12N 9/22(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 11/089(2020.01) C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01) C12N 15/10(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种PDA@CRISPR/Cas9/sgHMGA2 NPs复合 体、 制备方法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种PDA@CRISPR/Cas9/ sgHMGA2 NPs复合体、 制备方法及应用， 该复合体 是由聚多巴胺包裹CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合 物构成的一种纳米颗粒， 该复合体利用聚多巴胺 的生物分子转运功能及其良好的生物相容性， 高 效且安全地将CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物运 送到细胞内， 实现对靶基因HMGA2的高效编辑， 该 复合体能够实现对CRISPR/Cas9基因编辑系统的 高效递送及对癌细胞基因组HMGA2的高效靶向敲 除， 可用于开发CRISPR/Cas9基因编辑系统的精 确靶向治疗方法， 作为一种针对HMGA2高表达型 癌症的新型靶向治疗手段进行研究， 用于揭示 CRISPR/Cas9基因编辑系统对HMGA2高表达型癌 症治疗过程中的功能作用， 为PDA包裹CRISPR/ Cas9基因编辑系统对HMGA2高表达的癌症患者进 行精准靶向生物治 疗提供临床前 数据依据。 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图3页 CN 114426960 A 2022.05.03 CN 114426960 A 1.一种PDA@CRISPR/Cas9/sgHMGA2  NPs复合体， 其特征在于， 所述 复合体是由聚多巴胺 包裹CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物构成的一种纳米颗粒， 所述CRISPR/Cas9核糖核蛋白复 合物包括CRISPR/Cas9‑3NLS和sgHMGA2， 所述CRISPR/Cas9‑3NLS为带有3个核定位信 号系统的 核酸内切 酶， 所述sgHMGA2为三个特异性靶向HMGA2基因的单链向导RNA，  sgHMGA2对应的 DNA序列为SEQ  ID NO.:4、 5、 6中任意 一条所示。 2.一种PDA@CRISPR/Cas9/sgHMGA2  NPs复合体的制备方法， 其特征在于， 所述 复合体的 制备方法包括以下步骤： S1、 CRISPR/Cas9‑3NLS的制备； S1.1、 根据pET28a/Cas9 ‑Cys载体序列， 设计SEQ  ID NO.:1所示特异性引物  N3‑F， 设计 SEQ ID NO.:2 所示特异性引物N3 ‑R； S1.2、 使用N3 ‑F和N3‑R引物及高保真酶POD ‑plus‑Neo对底物  pET28a /Cas9‑Cys进行 PCR扩增； S1.3、 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收目的PCR产物； S1.4、 PCR产物经磷酸化及自连， 亚克隆到大肠 杆菌 DH5α 中， 再经菌落PCR及测序， 鉴定 筛选包含可编码三个N LS的核苷酸序列的载体； S1.5、 以感受态细胞Rosetta为原核表达系统， 诱导CRISPR/Cas9‑3NLS的表达， 回收纯化 浓缩获得高纯度的CRIS PR/Cas9‑3NLS； S2、 sgHMGA2的制备； S2.1、 针对  SEQ ID NO.:3所示的  HMGA2基因片段设计SEQ  ID NO.:4、 SEQ ID NO.:5和 SEQ ID NO.:6所示的  CRISPR/Cas9 靶标序列； S2.2、 合成  SEQ ID NO.: 7、 SEQ ID NO.:8、 SEQ  ID NO.:9 、 SEQ ID NO.:10 、 SEQ ID  NO.:11和SEQ ID NO.:12 所示的带接 头的靶标序列及其互补序列； S2.3、 再经退火处理获得三个针对HMGA2基因的sgRNA  双链 DNA 片段作为插入片段， 将其分别与内切酶处理过的DR274  载体重组连接， 形成三个可转录sgHMGA2的重组原核表 达质粒： DR274 ‑sgHMGA2‑1、 DR274‑sgHMGA2‑2和DR274 ‑sgHMGA2‑3； S2.4、 用限制性核酸内切酶对上述三个质粒进行酶切， 电泳纯化回收含有T7启动子及 可转录sgHMGA2序列的消化产物并将其作为模板， 体外转录并提取纯化后获得的三个靶向 HMGA2的sgRNA， 分别为sgH MGA2‑1、 sgHMGA2‑2和sgHMGA2‑3； S3、 PDA@CRISPR/Cas9/sgH MGA2 NPs复合体的制备； S3.1、 将S1.5所述的CRISP R/Cas9‑3NLS与S2.4所述的sgHMGA2以终浓度160nM  ： 320nM的 比列在37℃条件下静置 于NE Buffer 2中30分钟， 形成CRIS PR/Cas9‑3NLS/sgHMGA2复合物； S3.2、 将27mg/ ml的盐酸多巴胺与上述CRISPR/Cas9‑3NLS/sgHMGA2复合物以3： 2的体积比 共孵育， 形成P DA@CRISPR/Cas9/sgH MGA2 NPs复合体。 3.根据权利要求2所述的一种PDA@CRISPR/Cas9/sgHMGA2  NPs复合体的制备方法， 其特 征在于， S1所述N3 ‑F的5’端包含可编码一个NLS的核苷酸序列， S1所述N3 ‑R的5’端包含可编 码两个NLS的核苷酸序列。 4.根据权利要求2所述的一种PDA@CRISPR/Cas9/sgHMGA2  NPs复合体的制备方法， 其特 征在于， S2.3所述内切酶选用BbsI  限制性内切酶。 5.根据权利要求2所述的一种PDA@CRISPR/Cas9/sgHMGA2  NPs复合体的制备方法， 其特权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114426960 A 2征在于， S2.4所述限制性内切酶选用DraI限制性内切酶。 6.根据权利要求2所述的一种PDA@CRISPR/Cas9/sgHMGA2  NPs复合体的制备方法， 其特 征在于， S3.1所述的sgHMGA2包 括sgHMGA2‑1、 sgHMGA2 ‑2和sgHMGA2 ‑3， 用量比为sgHMGA2 ‑1： sgHMGA2‑2： sgHMGA2‑3=1： 1： 1。 7.根据权利要求2所述的一种PDA@CRISPR/Cas9/sgHMGA2  NPs复合体的制备方法， 其特 征在于， S3.2所述共孵 育的溶液pH值为8.5。 8.根据权利要求2所述的一种PDA@CRISPR/Cas9/sgHMGA2  NPs复合体的制备方法， 其特 征在于， S3.2所述复合体形态为核壳状的纳米颗粒。 9.一种CRISPR/Cas9  基因编辑系统的靶向治疗应用， 其特征在于， 所述应用采用权利 要求1所述的P DA@CRISPR/Cas9/sgH MGA2 NPs复合体来实现。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114426960 A 3