(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111662737.6 (22)申请日 2021.12.31 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 梁可莹　詹金彪　梅圣圣　彭珊珊　 陈洁　高向征　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 专利代理师 赵杭丽 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/395(2006.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种全人源 抗PD-1的单克隆抗体No.1-10及 其应用 (57)摘要 本发明提供一种全人源抗PD ‑1的单克隆抗 体No.1‑10及其应用。 所述抗体包含重链和轻链 可变区的氨基酸序列。 本发明从人噬菌体抗体库 中筛选出抗PD‑1的单链抗体scFv ‑1， 通过基因工 程技术， 将sc Fv‑1的抗体可变区与恒定区序列拼 接， 建立表达全长抗体的工程化细胞株， 最后筛 选和纯化得到全长抗体No.1 ‑10。 其结构包含抗 体重链可变区、 轻链可变区， 以及恒定区； 具备高 亲和力， KD值为10‑12M； 能识别细胞表面的PD ‑1并 有效阻断PD‑1与PD‑L1的结合； 在与肿瘤细胞共 培养体系中具备较好的逆转T细胞免疫抑制的作 用。 该抗体免疫原性低， 稳定性高， 可用于肿瘤免 疫治疗。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图3页 CN 114539407 A 2022.05.27 CN 114539407 A 1.一种全人源抗PD ‑1的单克隆抗体No.1 ‑10， 其特征在于， 包含重链可变区和轻链可变 区， 以及抗体恒定 区， 所述重链可变区VH的多核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 所述重链可 变区VH的氨基酸序列如SEQ  ID No.2所示， 所述轻链可变区VL的多核苷酸序列如SEQ  ID  No.3所示， 所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ  ID No.4所示。 2.权利要求1所述的一种全人源抗PD ‑1的单克隆抗体No.1 ‑10， 其特征在于， 所述抗体 No.1‑10包含完整的互补决定区CDR1、 CDR2和CDR3； 所述的重链可变区VH  CDR1的氨基酸序 列为:HNINTF， 重链可变区VH  CDR 2的氨基酸序列为： AAS， 重链可变区VH  CDR3的氨基酸序 列为： QQANSFPRT； 所述的轻链可变区VL  CDR1的氨基酸序列为： GYRFGSYY， 轻链可变区VL   CDR2的氨基酸序列为： I NPTGGYT； 轻链可变区VL  CDR3的氨基酸序列为： ARDLG GSGYSHFDY 。 3.一种重组DNA表达载体， 其特征在于， 包含所述的重链可变区的多核苷酸序列SEQ  ID  No.1或轻链可变区的多 核苷酸序列SEQ  ID No.3。 4.权利要求1所述全人源抗PD ‑1的单克隆抗体No.1 ‑10在制备肿瘤免疫治疗抗体药物 中的应用。 其特 征在于， 所述肿瘤为 三阴性乳腺癌。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114539407 A 2一种全人源抗PD ‑1的单克隆抗体No.1 ‑10及其应用 技术领域 [0001]本发明抗体工程技术领域， 具体涉及一种全人源抗PD ‑1的单克隆抗体No.1 ‑10及 其应用。 背景技术 [0002]程序性细胞死亡受体 1(PD‑1)是由pdcd1基因编码的一种I型跨膜糖蛋白， 具有288 个氨基酸的蛋白质。 结构分为胞外区免疫球蛋白可变区样结构域、 跨膜区以及胞内区。 其 中， PD‑1的胞内结构域， 包括两个重要的酪氨酸基序， 分别是免疫受体酪氨酸基抑制基序 (ITIM)和免疫受体酪氨酸基转换基序(ITSM)。 PD ‑1属于CD28超家族 中的一员， 主要表达在 活化的T细胞表 面， 以及NK细胞， B细胞， 肿瘤相关巨噬细胞等。 1992年， Tasuku  Honjo教授首 先在小鼠体内分离和鉴定了PD ‑1基因， 并认 为PD‑1分子的活化会导致T细胞的凋亡。 但 直至 1999年， 科研人员通过对PD ‑1缺失的小鼠的研究观察到小鼠的自身免疫疾病发生的现象， 才逐步阐明了PD ‑1的免疫抑制功能。 PD ‑1的配体有PD ‑L1(又称B7 ‑H1或CD274)和PD ‑L2(又 称B7‑DC或CD273)。 PD ‑L1可表达于不同类型的细胞上， 包括免疫细胞， 上皮细胞， 内皮细胞， 尤其是肿瘤细胞。 PD ‑L2仅表达于抗原提呈细胞(AP Cs)。 促炎症细胞因子， 如I型和II型干扰 素、 肿瘤坏死因子α(TNF ‑α )和血管内皮生长因子(VEGF)的表达可诱导细胞PD ‑L1和PD‑L2的 表达。 在机体的免疫应答过程中， T细胞的激活， 除了需要第一信号， 即T细胞受体识别APCs 上的组织相容复合体(MHC)提呈的抗原肽， 还需要共刺激信号， 即共刺激受体CD28结合APC s 的B7受体。 但若共抑制受体PD ‑1结合配体PD ‑L1或PD‑L2， 则抑制T细胞的增殖。 因此， 使用 PD‑1/PD‑L1抗体， 可以阻断免疫检查点PD ‑1/PD‑L1信号， 恢复T细胞的增殖和杀伤能力， 从 而达到杀伤肿瘤 细胞的目的。 [0003]距离1986年FDA批准的第一款单克隆抗体药物， 至今已有超过100款抗体药物获批 上市。 目前， 抗体工程技术的出现加速了人源抗体的制备和筛选， 通过基因工程技术制备的 重组抗体主要包括人鼠嵌合抗体、 人源化抗体、 全 人源化抗体等等。 噬菌体展示技术具备筛 选周期短、 体外高亲和力成熟、 无需抗原免疫等优点， 成为全人源抗体制备的主要技术平 台。 [0004]噬菌体展示技术是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬 菌体外壳蛋白结构基因的适当位置， 使其能与噬菌体的衣壳蛋白形成融合蛋白， 随子代噬 菌体的重新组装呈现在噬菌体表面， 可以保持相对的空间结构和 生物活性。 将抗体片段与 噬菌体衣壳蛋白融合表达展示于噬菌体表面， 可以得到噬菌体展示抗体库， 主要有以下三 种类型： scFv库(由VH和VL 组成， 并由一个小肽(Gly4Ser)3连接成一个单链多肽)、 Fab库(含 有VH‑CH和VL‑CL， 并由二硫键连接在一起)和VHH库(只有重链可变区)。 噬菌体抗体库的筛 选模拟了抗体亲和力成熟的过程。 利用靶抗原， 采用合适的淘洗方法， 洗去未特异 性结合的 噬菌体。 再用酸 或者竞争的分子洗脱 下结合的噬菌体， 中和 后的噬菌体感染大肠杆菌扩增， 经过3‑5轮的富集， 逐步提高可以特异 性识别靶抗原的噬菌体比例， 最 终获得识别靶抗原的 高亲和力噬菌体抗体。说　明　书 1/6 页 3 CN 114539407 A 3