(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111657362.4 (22)申请日 2021.12.3 0 (71)申请人 杭州医学院 地址 310013 浙江省杭州市滨江高教园区 (72)发明人 高孟　吴洁　朱赟　沈钱通　 张柯欣　安彤　李思奇　陈刚　 庄昉成　陆绍红　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 邱启旺 (51)Int.Cl. C12N 7/01(2006.01) C12N 7/02(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/861(2006.01)A61K 38/16(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒、 制备 方法及应用 (57)摘要 本发明提供了一种具有抗肿瘤免疫功能重 组腺病毒、 制备方法及应用， 本发明将一种表达 融合蛋白CD13 7L‑PP4基因插入腺病毒载体， 构建 获得具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒， 所述融合 蛋白CD13 7L‑PP4包含CD13 7L蛋白和具有T细胞激 活功能的PP4多肽。 该重组腺病毒能在体内表达， 可以诱导产生特异性的抗肿瘤细胞免疫， 实现肿 瘤的免疫治疗。 因而可以用于制备用于诱导机体 产生针对CD137L的特异性细胞免疫反应的药物 和/或诱导机体产生抑制肿瘤细胞增殖的药物。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 114369581 A 2022.04.19 CN 114369581 A 1.一种具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒， 其特征在于， 所述具有抗肿瘤免疫功能重组 腺病毒表达融合蛋白CD137L ‑PP4， 所述融合蛋白CD137L ‑PP4包含CD137L蛋白和具有T细胞 激活功能的P P4多肽。 2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒， 其特征在于， 所述PP4多肽 来自白喉毒素无毒突变体蛋白中的第113 ‑127位序列， 该序列具有促进淋巴细胞增殖的作 用。 3.根据权利 要求2所述的具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒， 其特征在于， 所述CD137L蛋 白和具有T细胞激活功能的PP4多肽通过连接序列GGGS连接， 所述融合蛋白CD137L ‑PP4的氨 基酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 4.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤免疫功能重组腺病 毒， 其特征在， 编码所述融合蛋 白CD137L ‑PP4的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 5.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤免疫功能重组腺病 毒， 其特征在于， 所述腺病 毒载 体是5型腺病毒载体、 26型腺病毒载体或28型腺病毒载体。 6.一种权利要求1 ‑5任一项所述的具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒的构建方法， 其特 征在于， 具体为： 人工合成编码融合 蛋白CD137L ‑PP4的核苷酸序列， 通过同源重组的方法插入腺病毒载 体， 构建得到 重组腺病毒r Ad‑CD137L‑PP4。 7.根据权利要求6所述的构建方法， 其特 征在于， 还 包括纯化 步骤， 具体为： 用HEK293细胞培养所述构建得到的所述重组腺病毒rAd ‑CD137L‑PP4得到病毒培养液， 经多次反 复冻融后收集上清， 用超滤方法对所得上清进 行浓缩， 获得病毒浓缩液。 将所述病 毒浓缩液， 先用阴离 子交换层析进行 纯化， 再用分子 筛层析进行 纯化得到病毒纯化液。 8.根据权利要求7所述的构建方法， 其特征在于， 所述超滤方法为切向流超滤方法。 所 述阴离子交换层析所用的填料可以是SOURCE30Q或者DEAE。 所述分子筛层析所用的填料可 以是Superdex20 0pg。 9.一种权利要求 ‑5任一项所述的具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒的应用， 其特征在 于， 所述具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒在制备用于诱导机体产生针对CD137L的特异性细 胞免疫反应的药物和/或诱 导机体产生抑制肿瘤 细胞增殖的药物中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述诱导机体产生针对CD137L的特异性 细胞免疫反应的药物具体为 诱导特异性 IFN‑γ的效应T细胞的药物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114369581 A 2一种具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒 、 制备方法及应用 技术领域 [0001]本发明属于医学生物制品领域， 特别适用于一种具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒 的制备方法及应用。 背景技术 [0002]CD137L(CD137配体)， 又名4 ‑1BBL， 属于肿瘤坏死因子超家族成员， 是一种 Ⅱ型跨 膜糖蛋白。 4 ‑1BBL， 以同源三聚体存在， 以延伸的三叶样螺旋结构为特征， 发挥其生物学功 能。 它作为CD137的高亲和力配体,表达于活化的抗原递呈细胞(APC)表 面,包括巨噬细胞、 B 细胞和树突状细胞及 多种肿瘤细胞的表 面等。 作为一对重要的共刺激分子， CD137L与CD137 通过在免疫细胞间传递活化、 增殖或者凋亡信号 来调节T细胞介导的免疫反应。 [0003]CD137L与其受体结合， 可启动双向信号转导： 正向信号可刺 激T细胞活化和增殖； 反向信号可刺激B细胞增殖。 CD137L及其受体在正常组织及炎症中表达不显著， 而在肿瘤组 织中呈现高水平表达， 这种表达异常与肿瘤发生、 恶化存在一定的相关性。 肿瘤细胞介导的 CD137L/CD137异常表达已在很多肿瘤中被发现， 包括直肠癌、 黑色素瘤、 卵巢癌等恶性肿 瘤。 因此， 以CD137L与其受体结合作为靶点开展相关研究已成为当前抗肿瘤免疫研究领域 的一大热点。 因而， 以CD137L/CD137为靶抗原开展药物研究， 通过诱导机体产生特异 性细胞 毒性T淋巴细胞(CTL)来实现抗肿瘤免疫治疗有着很强的临床应用潜力。 目前， 已有针对 CD137L/CD137的抗肿瘤治疗主要以抗体治疗为主， 如辉瑞公司研发的全人源化CD137单抗 Utomilumab(PF ‑05082566)， 被批准用于晚期实体瘤和恶性B细胞白血病的 Ⅰ期临床 (NCT01307267)试验， 该药物临床耐受性良好， 且展现出一定的抗肿瘤 治疗效果。 但是， 由于 肿瘤细胞的免疫逃逸， 使得单抗类药物的治疗存在较大几率的耐药性。 因此， 通过激活机体 自身的细胞免疫来实现抗肿瘤治疗成为了一种研发思路。 重组腺病毒载体作为一种新型的 治疗手段， 在肿瘤 治疗领域已有一些应用， 借助重组腺病毒 载体诱导机体产生针对CD137L/ CD137的特异性细胞免疫是肿瘤生物治疗的一种新思路。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤免疫功能的重组腺病毒， 将CD137L ‑PP4的核 苷酸序列通过同源重组插入腺病毒载体构建得到一个能够表达CD137L ‑PP4蛋白的重组腺 病毒(rAd ‑CD137L‑PP4)， 该重组腺病毒诱导机体产生针对CD137L的特异性细胞免疫反应， 并且具有诱 导机体产生针对CD137L的特异性细胞免疫和抑制肿瘤 细胞增殖的功能。 [0005]本发明采用的技 术方案如下： [0006]一种具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒， 是表达融合蛋白CD137L ‑PP4的重组腺病 毒， 所述融合蛋 白CD137L ‑PP4是将人CD137L序列的蛋白与一个通过筛选获得的具有T细胞 激活功能的多肽P P4通过连接序列进行 连接获得。 [0007]进一步地， 所述CD137L ‑PP4的氨基酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 其中第1 ‑246位为 CD137L蛋 白， 第247 ‑250位为两个蛋白之间的连接序列， 第251 ‑265位为PP4多肽， 所述多肽说　明　书 1/5 页 3 CN 114369581 A 3