(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202111614627.2 (22)申请日 2021.12.28 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113980901 A (43)申请公布日 2022.01.28 (73)专利权人 上海惠盾因泰生物科技有限公司 地址 200120 上海市浦东 新区中国 （上海） 自由贸易试验区张杨路707号二层西 区205室 (72)发明人 吁亭　蒋应明　陈国友　 (74)专利代理 机构 上海一平知识产权代理有限 公司 3126 6 专利代理师 徐迅　崔佳佳 (51)Int.Cl. C12N 5/0784(2010.01) C12N 5/0786(2010.01) A61K 39/00(2006.01) A61K 39/21(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61P 31/18(2006.01)A61P 31/20(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 105647867 A,2016.0 6.08 CN 106701680 A,2017.0 5.24 CN 105132373 A,2015.12.09 CN 10424 4975 A,2014.12.24 EP 1671643 A1,20 06.06.21 US 202013147 7 A1,2020.04.3 0 US 201328080 5 A1,2013.10.24 郭建巍等.用GM-CSF和IL-4在体外诱导高纯 度CD14+树 突状细胞. 《生物医学工程学杂志》 .2002,第19卷(第2期), Lingdi Zhao et al. .Survival benefit from Rectro Nectin-activated cyto kine- induced k iller cells combi ned with chemotherapy i n advanced EGFR w ild-type lung aden ocarcinoma. 《Immunotherapy》 .2018, 第10卷(第6期), 审查员 刘宁伟 (54)发明名称 一种制备高纯度的成熟人树突状细胞的方 法及应用 (57)摘要 本发明涉及一种制备高纯度、 成熟人树突状 细胞的方法及应用， 具体地， 本发明通过单核细 胞诱导分化为高纯度的非成熟树突状细胞、 非成 熟树突状细胞摄取加工抗原、 非成熟树突状细胞 诱导为成熟树突状细胞几个环节， 使得制备的树 突状细胞具有高纯度、 高得率， 可有效摄取加工 抗原， 诱导活化抗原特异性的CTL杀伤肿瘤细胞。 权利要求书1页 说明书12页 附图4页 CN 113980901 B 2022.06.17 CN 113980901 B 1.一种诱 导单核细胞分化 为树突状细胞的方法， 其特 征在于， 包括 步骤： (a) 提供一经终浓度为1 ‑10μg/mL的重组人纤维连接蛋白片段试剂包被的培养瓶， 所 述重组人纤维连接蛋白片段 试剂为重组人纤维连接蛋白片段Ret ronectin； (b) 在所述经包被的培养瓶中， 在含100ng/ml ‑400ng/ml的rhGM ‑CSF的第一基础培养 基的培养体系中， 培养单个核细胞1 ‑4小时， 从而使 得单个核细胞中的单核细胞贴壁于所述 培养瓶； (c) 将所述培养体系中贴壁的单核细胞与悬浮的细胞进行分离， 并对所述培养瓶贴壁 的单核细胞进行洗涤， 从而 去除残留的悬浮细胞， 获得 经分离的贴壁单核细胞； (d) 在添加了血清替代品或AB型血清、 rhGM ‑CSF和rhIL ‑4的第二基础培养基中， 并在 合适的培养条件 下， 对上一步骤获得的经分离的贴壁单核细胞进 行培养3‑5天后， 从而获得 纯度大于80%的非成熟树 突状细胞； (e) 用感兴趣的抗原对所述非成熟树突状细胞进行致敏处理， 从而获得经所述抗原致 敏的非成熟树 突状细胞； 和 (f) 将步骤(e)获得的经抗原致敏的非成熟树突状细胞， 在添加了5 ‑15μg/ml PGE2， 500‑1500IU/ml  TNFα和1‑10 μg/ml CD40L的第三基础培养基中， 并在合适的培养 条件下， 培 养16‑60小时后， 从而获得 悬浮的成熟树 突状细胞。 2.如权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤(b)中， 将 分离的PBMC作 为单个核细胞 接种于所述的培 养体系。 3.如权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤(d)中， AB 型血清的体积浓度为2 ‑ 10%， rhGM ‑CSF浓度为10 0ng/ml‑400ng/ml， rhI L‑4浓度为10 0ng/ml‑1000ng/ml。 4.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤(d)中， 还包括对培养体系的培养 基进行换液处理， 并且对换下 的培养基中悬浮的树突状细胞进行离心收集后， 用新鲜的第 二培养基重悬后传回原培 养瓶中继续培 养。 5.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤(e)中， 所述的感兴趣的抗原包括肿瘤 相关抗原、 病毒抗原或其组合。 6.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(f)中获得的悬浮的成熟树突状细胞的 纯度大于80%。 7.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的第一基础培养基、 第二基础培养基和 第三基础培 养基均为RPMI  1640培养基。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113980901 B 2一种制备高纯度的成熟人树突状细胞的方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术和细胞治疗领域， 具体地， 本发明涉及一种高纯度的成熟人 树突状细胞的制备 方法及应用。 背景技术 [0002]树突状细胞(Dendrit ic cells， DC)是1973年由美国Steinman首先发现的， 因其成 熟时伸出许多树突状或伪足样突起而 得名。 DC是目前所知抗原 提呈功能最 强的APC， 最大的 特点是能够刺激初始T细胞(na ïve T cell)活化和增殖， 而Mφ、 B细胞等仅能刺激已活化的 T细胞或记 忆T细胞， 因此， DC是 特异性免疫应答的始动者， 在免疫系统中占有独特地 位。 [0003]DC可由骨髓中髓样干细胞和淋巴样干细胞分化而来， 分别称为髓系DC(myeloid   DC,MDC)、 淋巴系DC(lymphoid  DC， LDC)， 大多数DC来源于骨髓， 由骨髓进入外周血， 再分布 到全身组织。 DC广泛分布于脑以外的全身各器官， 数量少， 仅占外周血单个核细胞的1%以 下， 占小鼠脾细胞的0.2% ‑0.5%。 根据DC的成熟状态， 可将DC分为DC前体、 未成熟DC、 迁移期 DC和成熟DC。 DC前体细胞经血循环或淋巴循环进入多种实体器官及非淋巴组织的上皮部 位， 在某些细胞因子作用下分化、 发育为未成熟DC(immature  DC, iDC)。 正常情况下， 体内 绝大多数DC处于未成熟状态， 它们仅表达低水平的MHC Ⅱ类分子、 共刺激分子和粘附分子， 在体外激发MLR能力较弱； 但表达较多的FcR和病原体受体， 具有极强的摄取和加工处理抗 原的能力。 iDC在摄取抗原或受到某些刺激(主要是炎性信 号如LPS、 IL1β、 TNFα )后， 未成熟 DC即开始分化成熟。 成熟的DC(mature  DC， mDC)表达大量MHC Ⅱ类分子和共刺激分子(CD80、 CD40、 CD86等)， 能有效地将加工、 处理后的抗原以抗原肽 ‑MHCⅡ类分子复合物的形式提呈 给初始T细胞， 并使之激活。 [0004]全球范围的DC肿瘤疫苗研究持续了近20年， 目前， 全球已经有4种DC肿瘤疫苗已经 获得上市批准： Hybricell(Geno a Biotecnolo gia,巴西)、 CreaVaX  RCC(CreaGene,韩国)、 Sipuleuc el‑T(Dendreon,美国)、 APCEDEN(APAC  Biotech,印度)。 截止2 020年4月， 在美国国 立卫生研究院管理 的“Clinical  trail”临床数据登记平台显示， 以 “Dendritic  cells”为 关键词共有1024项DC细胞治疗临床试验登记， 包括62项临床 Ⅲ‑Ⅳ产品试验登记。 美国、 中 国、 欧盟是开发DC细胞治疗的主要国家和地区， 在美国开展的临床试验有503项， 中 国为103 项， 中国已经成为仅次于美国的D C研发热地。 在适应症方面， DC细胞治疗的主要适应症 为黑 色素瘤、 肾癌、 乳腺癌、 脑癌、 前列腺癌、 白血病和 HIV感染等， 在肿 瘤治疗领域， 全球处于临 床Ⅲ期的正在进行DC产品有13个。 [0005]获得高纯度、 成熟的、 可活化抗原特异性T淋巴细胞的DC是临床研究的关键。 常规 的制备DC的方法存在纯度低、 成熟度不够的情况， 容易导致细胞功能缺 失， 批间差异太大的 问题， 导致临床应用中效果 不佳或出现免疫耐受情况。 [0006]因此， 有必要对DC的培养方法进行进一步完善， 以有效提高DC疫苗在临床应用中 的疗效。说　明　书 1/12 页 3 CN 113980901 B 3