(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111609579.8 (22)申请日 2021.12.27 (71)申请人 苏州善佰生物技 术有限公司 地址 215100 江苏省苏州市吴中区苏州工 业园区星湖街218号生物医药产业园 B7-3楼 (72)发明人 穆延召　蔡军　孙钦利　徐小钒　 (74)专利代理 机构 合肥律通专利代理事务所 (普通合伙) 34140 专利代理师 吴奇 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) A61K 9/48(2006.01) A61K 35/745(2015.01)A61P 35/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种双歧杆菌的制备方法及其在肿瘤治疗 中的应用 (57)摘要 本发明涉及一种双歧杆菌的制备方法， 收集 临床接受PD ‑1抗体药物治疗的患者不同治疗周 期的粪便样本； 提取粪便样本的微生物DNA； 扩增 16S rDNA V3‑V4区序列， 将扩增产物测序； 根据 患者接受PD ‑1治疗后疗效的不同； 取疗效较好一 组患者的粪便， 用0.9％生理盐水按体积比1:100 进行稀释； 稀释后用涂布棒涂抹在双歧杆菌选择 性培养基上， 37℃厌氧培养； 挑选 单菌斑， 接种在 双歧杆菌选择性液体培养基中， 37℃厌氧培养 24h； 离心浓缩菌体， 检测确认分离的细菌是双歧 杆菌； 继续扩大培养即得双歧杆菌。 本发明双歧 杆菌制备方法简单， 用于治疗肿瘤是一种新的应 用方向， 也是一种新的治疗肿瘤的方法， 且无毒 副作用。 权利要求书1页 说明书3页 CN 114657086 A 2022.06.24 CN 114657086 A 1.一种双歧杆菌的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)收集临床接受P D‑1抗体药物治疗的患者 不同治疗周期的粪便样本； (2)提取粪便样本的微 生物DNA； (3)扩增16S  rDNA V3‑V4区序列， 将扩增产物测序； (4)根据患者接受PD ‑1治疗后疗效的不同， 将患者分为两组， 疗效较好的一组， 疗效不 好的一组， 分析两组患者粪便中微 生物组成结构的差异； (5)取疗效较好 一组患者的粪便， 用0.9％生理盐水按体积比1:10 0进行稀释； (6)稀释后用涂布棒涂抹在 双歧杆菌 选择性培 养基上， 37℃厌氧培 养； (7)挑选单菌斑， 接种在 双歧杆菌 选择性液体培 养基中， 37℃厌氧培 养24h； (8)离心浓 缩菌体， 检测 确认分离的细菌是双歧杆菌； (9)继续扩大培 养即得双歧杆菌 。 2.根据权利要求1所述的双歧杆菌的制备方法， 其特征在于， 所述检测确认的方法为， 提取离心浓缩菌体的DNA， 扩增16 s全长片段， 进 行一代测序， 测序结果显示分离的细菌是双 歧杆菌即可。 3.一种利用权利要求1所述的双歧杆菌制备胶囊药物的方法， 其特 征在于， 步骤为： (1)扩大培 养到对数期后， 离心， 获得双歧杆菌沉淀； (2)用0.9％的生理盐水重悬双歧杆菌， 10g双歧杆菌加入10 00ml生理盐水； (3)重悬后的双歧杆菌再次离心， 收集 沉淀； (4)再次用0.9％的生理盐水重悬双歧杆菌， 10g双歧杆菌加入10 0ml生理盐水； (5)在重悬后的双歧杆菌悬浮液中加入脱脂奶粉、 低聚果糖、 低聚半乳糖， 混匀得混悬 液； (6)将混悬 液倒入无菌 培养皿中， 形成一层薄 薄的液面； (7)将培养皿置于真空冷冻干燥机中， 真空干燥； (8)轻轻刮下干燥后的粉末， 装 入羟丙甲基纤维素胶囊中即得双歧杆菌胶囊。 4.权利要求1所述双歧杆菌或权利要求3所述双歧杆菌胶囊在肿瘤治疗中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114657086 A 2一种双歧杆菌的制备方 法及其在肿瘤治疗中的应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物工程技术领域， 尤其涉及 一种双歧杆菌的制备方法及 其在肿瘤治 疗中的应用。 背景技术 [0002]2018年6月15日， NMPA批准了国内首个免疫检查点抑制剂单抗药物： BMS的Opdivo (O药)， 用于非小细胞肺癌的二线治疗。 截止2019年底， 国内已经有BMS、 MSD、 上海君实、 苏州 信达、 江苏恒瑞的5个PD1药物获NMPA批准， 适应症包括： 非小细胞肺癌、 肝癌、 黑色素瘤等。 与此同时， 不仅5家已经获批的免疫检查点抑制剂在 扩大适应症， 还有 大量新的免疫检查点 抑制剂在临床和注 册审批阶段。 肿瘤治疗正逐步进入免疫 治疗阶段。 [0003]但是， 目前免疫检查点抑制剂的有效率偏低， 整体只有20％左右， 而且在不同患者 间存在巨大的差异， 进一步研究发现： 肿瘤PD1等免疫治疗的疗效与肠道菌群组成密切相 关。 Routy等分析了249名患肺癌、 肾癌等肿瘤并接受抗PD ‑1免疫抑制剂治疗的患者， 69名同 时接受广谱抗生素治疗(ATB),结果发现接受ATB 治疗的患者平均总生存期为8.3个月， 远远 低于非ATB患者的15.3个月。 York等人在黑色素瘤患者中发现， 接受抗PD1治疗有效的黑色 素瘤患者的口腔及肠道菌群， 多样性、 丰度及组成与无效者相比呈显著差异。 2017年， Gajewski等人发现长双歧杆菌与黑色素瘤患者对PD1抑制剂的响应相关， Wargo等人则鉴定 出疣微菌科与黑色素瘤患者对PD1抑制剂的响应相关。 而双 歧杆菌在肿瘤治疗中的应用及 运用方法尚未 见相关研究成果。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一种双歧杆菌的制备 方法及其在肿瘤治疗中的应用。 [0005]一种双歧杆菌的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： [0006](1)收集临床接受P D‑1抗体药物治疗的患者 不同治疗周期的粪便样本； [0007](2)提取粪便样本的微 生物DNA； [0008](3)扩增16S  rDNAV3‑V4区序列， 将扩增产物测序； [0009](4)根据患者接受PD ‑1治疗后疗效的不同， 将患者分为两组， 疗效较好的一组， 疗 效不好的一组， 分析两组患者粪便中微 生物组成结构的差异； [0010](5)取疗效较好 一组患者的粪便， 用0.9％生理盐水按体积比1:10 0进行稀释； [0011](6)稀释后用涂布棒涂抹在 双歧杆菌 选择性培 养基上， 37℃厌氧培 养； [0012](7)挑选单菌斑， 接种在 双歧杆菌 选择性液体培 养基中， 37℃厌氧培 养24h； [0013](8)离心浓 缩菌体， 检测 确认分离的细菌是双歧杆菌； [0014](9)继续扩大培 养即得双歧杆菌 。 [0015]作为优选， 所述检测确认的方法为， 提取离心浓缩菌体的DNA， 扩增16s全长片段， 进行一代测序， 测序结果显示分离的细菌是双歧杆菌即可。 [0016]一种利用双歧杆菌制备胶囊药物的方法， 其特 征在于， 步骤为：说　明　书 1/3 页 3 CN 114657086 A 3