(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111673749.9 (22)申请日 2021.12.31 (71)申请人 杭州荣谷生物科技有限公司 地址 310056 浙江省杭州市滨江区长河街 道滨安路68 8号4幢5层501室 (72)发明人 钱文斌　王世兵　陈洁　叶倩　 (74)专利代理 机构 上海九泽 律师事务所 313 37 代理人 蔡佳杰 (51)Int.Cl. C12N 7/01(2006.01) C12N 15/39(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A61K 35/768(2015.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种双突变溶瘤病毒、 构建方法及其用途 (57)摘要 本发明公开了一种双突变溶瘤病毒、 构建方 法及其用途。 所述双突变溶瘤病毒可操作地插入 外源基因PuroR、 外源基因EGFP； 所述外源基因 PuroR替换了病毒F 1L基因， 外源基因EGFP插入到 病毒TK区中； 双突变溶瘤病毒在制备用于 预防或 治疗肿瘤或/和癌症的药物中的用途。 所述肿瘤 或/和癌症包括结肠癌、 胰腺癌、 胃癌。 本申请创 造性地将病毒F 1L基因替换成P uroR基因， 插入双 突变溶瘤病毒中， 在保证病毒复制能力不受影 响 的同时增强了病毒的杀伤能力， 从而提高了治疗 效果。 权利要求书2页 说明书10页 序列表2页 附图6页 CN 114277002 A 2022.04.05 CN 114277002 A 1.一种双突变溶瘤病毒， 其特征在于： 所述双突变溶瘤病毒可操作地插入外源基因 PuroR、 外源基因EGFP； 所述外源基因PuroR替换了病毒F1L基因， 外源基因EGFP插入到病毒 TK区中。 2.根据权利要求1所述的一种双突变溶瘤病毒， 其特征在于： 所述外源基因PuroR基因 序列如SEQ  ID NO.1所示。 3.根据权利要求1所述的一种双突变溶瘤病毒， 其特征在于： 所述外源基因PuroR氨基 酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 4.一种双突变溶瘤病毒的构建方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 步骤1： 在6孔板内接种293A细胞； 取培养基， 加入痘苗病毒液， 充分震荡后， 加入6孔板 内， 在37℃， 5％CO2条件下培养， 吸去悬浮的痘苗病毒液； 进行质粒转染， 将外源基因PuroR 替换病毒F1L基因； 步骤2： 转染后， 收集细胞及上清液， 反复冻融， 离心， 收集上清液， 再次感染细胞， 并加 入puro进行 药筛， 药筛48h后， 进行 单克隆扩增， 获得外源基因PuroR替换 F1L基因的痘病毒； 步骤3： 在6孔板内接种293A细胞； 取培养基， 加入外源基因PuroR替换F1L基因的痘病 毒， 充分震荡后， 加入6孔板内， 在37℃， 5％CO2条件下培养， 吸去悬浮的病毒液； 进行质粒转 染， 插入外源基因EGFP； 步骤4： 转染后， 收集细胞及上清液， 反复冻融， 离心， 收集上清液， 再次感染细胞， 加入 按1:1:5体积比的霉酚酸、 黄嘌呤、 次黄 嘌呤， 混合均匀， 筛选后进行单克隆扩增， 获得双突 变溶瘤病毒。 5.根据权利要求4所述的一种双突变溶瘤病 毒的构建方法， 其特征在于： 质粒转染的操 作方法为： 将Opti ‑MEM培养基与Lipofectami ne3000试剂混合均匀， 得到试剂A； 取Opti‑MEM培养基稀释装载有外源基因的pCB穿梭质粒， 稀释至1μg/μL， 制备DNA预混 液； 取Opti‑MEM培养基、 P3000试剂和DNA预混液， 混合均匀， 得到试剂B； 在试剂B 中加入试 剂A， 混合均匀； 在室温孵 育10～20min， 加入DNA ‑脂质复合物。 6.根据权利 要求5所述的一种双突变溶瘤病毒的构 建方法， 其特征在于： Opti ‑MEM培养 基与Lipofectami ne3000试剂按125 μl:3.75 μl的容积比混合均匀， 得到试剂A； Opti‑MEM培养基、 DNA预混液、 P3000试剂按125μl： 2.5μg： 5μl的容积比混合均匀， 得到 试剂B； 试剂A、 试剂B按125 μl： 125 μl的容积比混合均匀。 7.根据权利要求4所述的一种双突变溶瘤病毒的构建方法， 其特征在于： 所述步骤2中 加入puro， 使终浓度为0.2 μg/ml。 8.根据权利要求4所述的一种双突变溶瘤病 毒的构建方法， 其特征在于： 所述单克隆扩 增过程为： 步骤一： 药筛结束后， 收集细胞及上清液， 反复冻融， 离心， 收集上清液； 在铺有293A细 胞的6孔板中稀释加入 获得的上清液， 在37℃， 5％CO2条件下培养， 吸去悬浮的病毒液， 加入 低熔点胶； 次日， 在显微镜下挑选单 克隆病毒； 步骤二： 将挑选的单克隆病毒加入铺有293A细胞的24孔板中， 培养一段 时间， 收集细胞 及上清液， 反复冻融， 离心， 收集上清液。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114277002 A 29.根据权利要求4所述的一种双突变溶瘤病毒的构建方法， 其特征在于： 步骤2扩增结 束后， 对外源基因PuroR替换F1L基因的痘病毒进行PCR检测， 外源基因PuroR的PCR引物包括 正向引物F1L ‑F‑3和反向引物F1L ‑R‑3， 所述正向引物F1L ‑F‑3的基因序列为ACAGATCTGATGAC CGACGA； 所述反向引物F1L ‑R‑3的基因序列为AG GGGAAACATAGGAGTCATTCT。 10.根据权利要求4所述的一种双突变溶瘤病 毒的构建方法， 其特征在于： 步骤4扩增结 束后， 对双突变溶瘤病毒进行PCR检测， 所述EGFP基因的PCR引物包括正向引物wtvvtk ‑F和 反向引物wtv vtk‑R， 所述正向引物wtv vtk‑F的基因序列为ACAGATCTGATGAC CGACGA； 所述反向引物wtv vtk‑R的基因序列为AG GGGAAACATAGGAGTCATTCT。 11.一种药物组合物， 其特征在于： 所述药物组合物包括如权利要求1～10中任意一项 所述双突变溶瘤病毒、 药 学上适用的载体和药物辅料。 12.根据权利要求11中所述的药物组合物在制备用于预防或治疗肿瘤或/和癌症的药 物中的用途。 13.根据权利要求12所述的用途， 其特征在于： 所述肿瘤或/和癌症包括结肠癌、 大肠 癌、 胰腺癌、 骨癌、 淋巴癌、 胃癌、 肝癌、 子宫癌、 宫颈癌、 卵巢癌、 肺癌、 脑癌、 乳 腺癌、 食道癌、 肾癌、 喉癌、 甲状腺癌、 恶性淋巴瘤、 多发性骨髓瘤、 脑垂体腺瘤、 睾丸肿瘤、 膀胱癌、 鼻咽癌、 口腔癌、 绒毛膜癌。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114277002 A 3