(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111599982.7 (22)申请日 2021.12.24 (71)申请人 武汉大学 地址 430072 湖北省武汉市武昌区八一路 299号 (72)发明人 汪付兵　黄兰祥　袁纯辉　荣媛　 (74)专利代理 机构 武汉宇晨专利事务所(普通 合伙) 42001 代理人 余晓雪 (51)Int.Cl. C12N 15/867(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61K 39/39(2006.01)A61K 47/46(2006.01) A61K 38/48(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种工程化外泌体原位纳米疫苗及其制备 方法和应用 (57)摘要 本发明公开了过表达α ‑LA的重组载体、 过 表达α‑LA的细胞系、 外泌体以及利用工程化改 造后富集α ‑乳清蛋白的乳 腺癌源外泌体制备的 纳米疫苗及其制备方法和应用。 本发 明的纳米疫 苗通过α ‑乳清蛋白特异性靶向肿瘤组织， 诱导 肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡并释放肿瘤相 关抗原、 Hiltonol和损伤相关的分子模式 （DAMPs） ， 原位激活1型常规树突状细胞， 进而引 发强大的肿瘤 特异性CD8+ T细胞反应， 表现出有 效的抗肿瘤活性。 本发明的纳米疫苗为靶向杀伤 肿瘤细胞提供新方法， 为原位激活1型常规树突 状细胞提供新模式， 为改善乳 腺癌的免疫治疗提 供新思路。 权利要求书1页 说明书7页 附图16页 CN 114410686 A 2022.04.29 CN 114410686 A 1.过表达α ‑LA的重组载体， 其特征在于， 所述重组载体是将α ‑LA基因克隆到慢病毒表 达载体中得到 。 2.过表达α ‑LA的细胞系， 其特征在于， 所述过表达α ‑LA的细胞系是包括将权利 要求1所 述的慢病毒表达载体转染乳腺癌细胞 得到。 3.根据权利要求2所述的过表达α ‑LA的细胞系， 其特征在于， 所述乳腺癌细胞为三阴性 乳腺癌细胞MDA ‑MB‑231细胞。 4.一种外泌体， 其特 征在于， 所述外泌体是从权利要求2或3所述的细胞系中提取 得到。 5.一种工程化外泌体原位纳米疫苗， 其特征在于， 所述工程化外泌体原位纳米疫苗包 括权利要求 4所述的外泌体。 6.权利要求5所述的工程化外泌体原位纳米疫苗的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 1） 将权利要求1所述的过表达α ‑LA的重组载体转染乳腺癌细胞， 制备得到表达α ‑乳清 蛋白的稳定细胞系； 2） 从细胞培 养上清中提取 得到富集α‑乳清蛋白的外泌体； 3） 通过电穿孔仪把免疫原性细胞死亡诱导剂ELANE和TLR3激动剂Hiltonol电转到所获 得外泌体中， 得到 工程化外泌体原位纳米疫苗。 7.权利要求1所述的过表达α ‑LA的重组载体、 权利 要求2~3任一项所述的过表达α ‑LA的 细胞系、 权利要求4所述的外泌体或权利要求5所述工程化外泌体原 位纳米疫苗在制备治疗 乳腺癌或乳腺癌免疫 治疗药物中的应用。 8.一种治疗乳腺癌的药物， 其特征在于， 所述药物含有如权利要求4所述的外泌体或权 利要求5所述的疫苗。 9.根据权利要求8所述的治疗乳腺癌的药物， 其特征在于， 所述乳腺癌为三阴性乳腺 癌。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410686 A 2一种工程化外泌体原位纳米疫苗及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于肿瘤免疫治疗药物技术领域， 具体涉及一种工程化外泌体原位纳 米疫 苗及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]作为最有效的抗原呈递细胞， 树突状细胞(DCs)是启动和调节肿瘤微环境中先天 免疫和适应性免疫的核心。 因此， 已经开发出多种靶向DCs的疫苗以改善癌症免疫治疗， 并 进行了多项临床试验， 但仍难以在临床上推广。 目前研究较为广泛的一种DCs疫苗， 是由抗 原和佐剂组成的DCs纳米疫苗， 该疫苗在体内多个位点直接激活和动员天然DCs亚群， 是增 强DCs抗肿瘤作用的重要方法。 然而， 由于佐剂缺乏靶向性， 易诱导全身免疫系统的非特异 性激活， 引发局部或全身的炎症反应， 存在难以避免的潜在免疫毒性副作用。 此外， 该策略 的另一个主要挑战是识别最佳免疫优势肿瘤抗原， 以引发有效的肿瘤特异性免疫反应。 解 决上述问题将有助于DCs疫苗在临床上的推广应用。 [0003]免疫原性细胞死亡(ICD)可增强肿瘤抗原暴露， 并促进肿瘤细胞内免疫刺激性容 物的释放， 已有研究将全肿瘤细胞ICD 裂解液用于自体DC疫苗的研发。 在体内诱导肿瘤细胞 ICD将为DCs疫苗提供广泛的抗原库， 而避免鉴定免疫优势 抗原。 cDC1s能有效处理和交叉呈 递肿瘤相关性外源性抗原， 进而激 活CD8+T细胞并反应， 然而， 在肿瘤 微环境中DCs通常不成 熟， 导致呈递肿瘤抗原的效率较低， 因此， 有必要将能有效激活体内cDC1s的免疫佐剂TLR3 激动剂递送至肿瘤 微环境中， 以此改善肿瘤 微环境中CD8+T细胞的募集、 浸润和功能。 因此， 将ICD诱导剂和TLR3 激动剂靶向递送到肿瘤组织将是原位激活肿瘤浸润cDC1s的理想方式。 [0004]近年来， 外泌体由于其低细胞毒性、 最大限度地提高药物生物利用度的能力以及 易于进行生物工程改造的特性， 是一种天然的药物递送载体， 利用外泌体开发的药物已有 多项临床试验， 进一步证明了其临床转化价值。 因此， 肿瘤来源的外泌体(T exs)可以作为无 细胞治疗载体， 将ICD诱 导剂和TLR3 激动剂共递送到肿瘤微环境中， 以原位激活cDC1s。 [0005]三阴性乳腺癌(TNBC)是一种特定的乳腺癌亚型， 其不表达雌激素受体(ER)、 孕激 素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)， 约占所有乳 腺癌的15％。 由于其特殊的分子表 型， TNBC对激素治疗或分子靶向治疗不敏感， 且常规术后辅助放化疗疗效较差。 TNBC转移后 的中位生存时间13.3个月， 术后复发率高达25％， 迫切需要开发新的TNBC治疗策略。 cDC1s 浸润与TNBC良好预后之间存在很强的相关性， 因此， 上述原 位激活cD C1s的治疗 策略有望改 善TNBC的治疗困境。 为了提高上述肿 瘤外泌体对TNBC的靶向性， 有必要对外泌体进行工程 化改造。 α ‑乳清蛋白(α ‑LA)是一种在大多数人类乳腺癌中表达的乳腺特异性免疫优势抗 原， 在外泌体表面富集α ‑LA， 有助于增强外泌体靶向能力和免疫原性。 鉴于此， 本发明设计 了载有ICD诱导剂ELANE和T LR3激动剂Hiltonol的α ‑LA工程化外泌体原位纳米疫苗， 用于治 疗改善乳腺癌的免疫 治疗。说　明　书 1/7 页 3 CN 114410686 A 3