ICS 65.020 B 05 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2946—2018 野生大豆抗胞囊线虫鉴定技术规范 Technical specifications for bioassay of wild soybean resistance to soybean cyst nematode (Heterodera glycines) 2018 - 12 - 13 发布 吉林省市场监督管理厅 2018 - 12 - 30 实施 发 布 DB22/T 2946—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由吉林省农业农村厅提出并归口。 本标准起草单位：吉林省农业科学院。 本标准主要起草人：袁翠平、董英山、王玉民、赵洪锟、刘晓冬、齐广勋、王英男、李玉秋、颜秀 娟。 I DB22/T 2946—2018 野生大豆抗胞囊线虫鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了野生大豆对大豆胞囊线虫抗性的鉴定方法和抗性评价。 本标准适用于野生大豆种质资源对大豆胞囊线虫的抗性鉴定与评价。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 胞囊 cyst 大豆胞囊线虫雌虫，每个胞囊内约含 200 粒～600 粒卵，从胞囊中孵化出来即为二龄幼虫。 2.2 胞囊指数（雌虫指数） female Index （FI） 接种后 28 d~30 d，供试植株根系上的胞囊数占感病对照植株根系上胞囊数的百分比。 2.3 大豆胞囊线虫类群 HG type Heterodera glycines type (HG type) 在形态上没有差异，但在寄主上具有显著致病性差异的大豆胞囊线虫群体，需采用特定的一套鉴别 寄主进行鉴别。目前主要采用Niblack等学者提出的HG type鉴别寄主。 3 鉴定方法 3.1 3.1.1 接种物的准备 大豆胞囊线虫的繁殖 3.1.1.1 宜使用本地区优势 HG type 或混合大豆胞囊线虫群体。 3.1.1.2 将含有大于 30 个/ 100 g 胞囊的病土装入高度 16 cm～25 cm，盆口径 15 cm～25 cm 的塑 料盆中，播种高感大豆品种，每盆 3 株～5 株。 3.1.1.3 出苗后 30 d～ 35 d，将大豆根系轻轻拔出，用高压水枪冲洗根系，将根系上的胞囊收集于 干净的塑料桶内。 3.1.2 胞囊和二龄幼虫悬浮液的制备 3.1.2.1 将含有胞囊的悬液倒入自上而下依次为 20 目, 40 目, 60 目的套筛上，将胞囊收集在 60 目 网筛上。 3.1.2.2 将 3.1.2.1 收集到的胞囊用橡胶棒碾碎，使之释放出卵和少数的二龄幼虫。用洗瓶冲洗卵和 二龄幼虫，将其冲入自上而下依次为 200 目，500 目的套筛上，将卵和二龄幼虫收集在 500 目网筛上。 3.1.2.3 用洗瓶将 500 目网筛上的卵和幼虫转移到烧杯中，加水配制成卵和幼虫悬浮液。 1 DB22/T 2946—2018 3.1.2.4 摇匀并用 100 μL 的移液器吸取一定量的卵和幼虫悬浮液置于载玻片上，通过 40 倍显微镜 观察计数卵和幼虫，配制成 2 000 个/mL 卵和幼虫的悬浮液，备接种用。 3.2 接种植物的准备 3.2.1 种子消毒 将健康饱满待鉴定的野生大豆、感病对照种子，用 1% 次氯酸钠溶液浸泡 3 min，期间搅动 2 次～ 3 次，然后用灭菌的蒸馏水冲洗 3 次～4 次。 3.2.2 种子萌发 3.2.2.1 消毒后的野生大豆种子在萌发前用无菌刀片在远胚芽处划破种皮。 3.2.2.2 将灭菌的滤纸放置在灭菌的培养皿内，然后将种子放置在湿润的滤纸上，于光照培养箱中 25 ℃ 发芽 3 d，期间保持滤纸湿润。 3.2.3 幼苗移栽 3.2.3.1 抗胞囊线虫鉴定试验在温度保持在 27 ℃±2 ℃ 温室内进行。 3.2.3.2 试验完全随机或随机区组设计，设 3 次重复，每个重复 5 株。 3.2.3.3 在直径 27 cm，高 30 cm 的塑料桶中放入 5 cm 厚的灭菌细砂，然后将直径 4 cm，长 25 cm 两端通透的 PVC 管插入细砂中，每个桶约插入 20 个 PVC 管，PVC 管内和管间填好细砂，且高度一致， 细砂距离上管口 2 cm。 3.2.3.4 将萌发 3 d 健壮的幼苗移栽于 PVC 管中，每管移栽 1 株，将移栽后的塑料桶置于 27 ℃～ 28 ℃的自动恒温水浴箱中。 3.3 接种 3.3.1 接种时期 幼苗移栽后 3 d～5 d。 3.3.2 接种方法、接种量 在距离供试植株 1 cm处用玻棒扎一个深 4 cm～5 cm的孔，用移液器向孔中注射 1 mL的卵和幼虫 悬浮液，用灭菌的细砂将孔填平。 3.4 接种后管理 苗期及时浇水，保持细砂湿润，温室温度保持在 27 ℃±2 ℃，每个处理定期施用等量营养液。 3.5 调查方法 3.5.1 调查时期 接种后 28 d～30 d。 3.5.2 3.5.2.1 调查记载方法 胞囊收集 3.5.2.1.1 将 PVC 管连同细砂和植株从桶中轻轻拔出，用高压水枪冲洗 PVC 管，将细砂和植株冲洗 到干净塑料桶中，再将胞囊从根系上冲洗到该塑料桶中。 2 DB22/T 2946—2018 3.5.2.1.2 将含有胞囊和细砂的悬浊液过 20 目, 40 目, 60 目的套筛，再向塑料桶注入自来水，摇 匀，将含有胞囊和细砂的悬浊液再过 20 目, 40 目, 60 目的套筛，如此重复 2 次，将胞囊收集在 60 目网筛上，将收集的胞囊用自来水冲洗转移到 15 mL 塑料管中保存。 3.5.2.2 胞囊计数 将收集在 15 mL 塑料管的胞囊混合液倒入计数培养皿中，并用少量水冲洗塑料管内壁，倒入计数 培养皿中，然后于 20 倍显微镜计数，即为该供试植株的根系胞囊数。 3.5.2.3 记载方法 分别记载每个重复每个供试品种和感病对照的胞囊数（表1）。 表1 野生大豆抗胞囊线虫鉴定调查汇总表 胞囊数 供试材料 平均胞囊数 个 重复 胞囊指数 抗性级别 个 1 2 3 4 5 Ⅰ 感病对照 Ⅱ Ⅲ Ⅰ 供试材料1 Ⅱ Ⅲ Ⅰ 供试材料2 Ⅱ Ⅲ Ⅰ 供试材料X Ⅱ Ⅲ 4 抗性评价 4.1 鉴定有效性 感病对照品种平均单株根系上的胞囊数超过100，判定该批次鉴定试验视为有效。 4.2 4.2.1 抗性评价标准 胞囊指数计算 3 DB22/T 2946—2018 根据胞囊指数确定供试野生大豆种质的抗性水平。按照下列公式（1）计算。 FI  T  100 .....................................(1) C 式中： T ——供试种质的平均胞囊数，单位为个每株（个/株）； C ——感病对照的平均胞囊数，单位为个每株（个/株）。 4.2.2 分级 抗性级别划分见表2。 表2 抗性级别划分 胞囊指数（FI） 抗性级别 FI<10 高抗 10≤FI<30 中抗 30≤FI<60 中感 FI≥60 高感 注：如果重复间抗性级别跨2个级别以上，应进行二次鉴定。 _________________________________ 4