ICS 11.220 B 41 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3053—2018 口蹄疫病毒 O 型抗体快速检测方法 镧系荧光免疫层析法 The Rapid Detection Methods for Antibodies to Foot and Mouth Disease Virus Type O Lanthanide Fluorescence Immunochromatographic Assay 2018 - 10 - 30 发布 辽宁省市场监督管理局 2018 - 11 - 30 实施 发 布 DB21/T 3053—2018 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 原理 .............................................................................. 1 4 仪器与试剂 ........................................................................ 1 4.1 仪器 .......................................................................... 1 4.2 试剂 .......................................................................... 1 5 样品采集与处理 .................................................................... 2 5.1 样品的采集 .................................................................... 2 5.2 样品的处理 .................................................................... 2 5.3 样品的贮存 .................................................................... 2 6 检测方法 .......................................................................... 2 6.1 6.2 6.3 6.4 样品稀释 ...................................................................... 加样 .......................................................................... 检测 .......................................................................... 有效性判定 .................................................................... 2 2 2 2 7 结果判定 .......................................................................... 2 附录 A（规范性附录） 样品稀释液的配置 ................................................ 4 I DB21/T 3053—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1给出的规则起草。 本标准由辽宁省畜牧兽医局提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准起草单位：辽宁省动物医学研究院、辽宁省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：顾贵波、杨本勇、申贯男、李井春、关淼、王宏燕、王竹、杨国丽。 II DB21/T 3053—2018 口蹄疫病毒 O 型抗体快速检测方法 镧系荧光免疫层析法 1 范围 本标准规定了以镧系荧光免疫层析法检测牛、羊、猪血清中的口蹄疫病毒O型抗体的检测方法。 本标准适用于牛、羊、猪血清中口蹄疫病毒O型抗体水平的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 原理 采用免疫夹心法和镧系荧光免疫层析法相结合技术，检测动物血清样本中的口蹄疫病毒O型抗体。 将镧系纳米荧光微球作荧光示踪物标记口蹄疫病毒O型重组抗原，血清样本抗体与镧系纳米荧光微球标 记的口蹄疫病毒O型重组抗原接触形成复合物后，继续与硝酸纤维素膜上检测线包被的口蹄疫病毒O型重 组抗原发生反应，形成抗原-抗体-荧光微球标记抗原免疫复合物，最后用荧光检测仪读取检测卡上的荧 光信号。 4 仪器与试剂 4.1 仪器 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 镧系荧光检测仪：激发波长为 400 nm±20 nm，检测波长为 615 nm±10 nm。 单道可调移液器：10 μL ～100 μL，0.5 μL ～10 μL。 分析天平：感量 0.0001 g。 离心机。 冰箱：2 ℃～8 ℃，-20 ℃。 4.2 试剂 4.2.1 样品稀释液：见附录 A。 4.2.2 口蹄疫病毒 O 型抗体荧光免疫试剂卡：镧系荧光微球标记的口蹄疫病毒 O 型重组抗原和鸡 IgY 埋置在标记物垫内；硝酸纤维膜上的测试线（T）和参考线（C）分别包被口蹄疫病毒 O 型重组抗原和羊 1 DB21/T 3053—2018 抗鸡 IgY 的 IgG。（见图 1） 图1 口蹄疫病毒 O 型抗体镧系荧光免疫层析卡示意图 5 样品采集与处理 5.1 样品的采集 应按照NY/T 541中的规定进行，并做好安全防护。按常规方法用干燥、洁净的离心管或适当容器采 集3 mL～5 mL血液。 5.2 样品的处理 血液样本用离心机3000 r/min离心3 min，分离血清，血清量不少于500 μL。 5.3 样品的贮存 血清样本在2 ℃～8 ℃冷藏可保存24 h，如需长期保存应置-20 ℃或-80 ℃。 6 检测方法 6.1 样品稀释 将待检血清样本用样品稀释液进行 50 倍稀释。 6.2 加样 将镧系荧光免疫层析卡置于干净平坦的台面上，用移液器吸取已稀释好的待检样本垂直滴加 80 μ L 于加样孔内。 6.3 检测 避光层析 15 min～20 min，30 min 内用镧系荧光检测仪检测，读取效价。 6.4 有效性判定 控制线（C线）检测到荧光信号，实验结果有效。 7 结果判定 2 DB21/T 3053—2018 效价≥128 时，判为阳性；效价＜64 时，判为阴性；效价在 64～128 之间时，判为可疑。 _________________________________ 3 DB21/T 3053—2018 AA 附 录 A （规范性附录） 样品稀释液的配置 A.1 A.2 A.3 A.4 A.5 A.6 A.7 A.8 A.9 A.10 A.11 称取 Na2HPO4·12H2O 称取 NaH2PO4·2H2O 称取 NAN3 称取硫酸葡聚糖（MW:40000） 量取Tween-201 L 800 mL双蒸水放入1 L烧杯。 A.1、A.2、A.3同时放入A.6烧杯中搅拌溶化。 A.4 加入A.7烧杯中混匀。 A.5 加入A.8烧杯中混匀。 用双蒸水将A.9烧杯溶液定容至1 L。 混匀后分装，置 4 ℃备用。 4.02 g 0.66 g 1.5 g 1.5 g 3.75 mL _________________________________ _________________________________ 4