ICS 65.020 B 39 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3244—2018 霍山石斛分子鉴定技术规程 The technical specifications for molecular indentification of Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng 文稿版次选择 2018 - 12 - 29 发布 安徽省市场监督管理局 2019 - 01 - 29 实施 发 布 DB34/T 3244—2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由皖西学院提出。 本标准由安徽省林业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：皖西学院、霍山县石斛（灵芝）产业发展办公室。 本标准主要起草人：赵群、陈乃富、陈存武、韩邦兴、孙传伯、戴军、宋向文、陈乃东、姚厚军、 李世海。 I DB34/T 3244—2018 霍山石斛分子鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了霍山石斛（Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng）分子鉴定的术语 与定义、分子鉴定技术、资料记录和档案管理。 本标准适用于霍山石斛与河南石斛、细茎石斛、铁皮石斛、金钗石斛之间的定性分子鉴定。 鉴定材料包括以上各种石斛的根、茎、叶、花、果实以及干条、枫斗、切片和含有霍山石斛成分的 粉末。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB34/T 486 霍山石斛 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 特异性引物 specific primer 能特异性扩增霍山石斛 ITS 或 trnL-trnF DNA 片段的位点特异性鉴别引物。 3.2 标准物种的特异性扩增片段 the specific sequence of standard species 用特异引物 CP2s 和 CP2a 扩增出的霍山石斛 DNA 片段。 3.3 标准物种扩增片段的特异性位点 the specific site of the sequence of standard species 用特异性引物 HuoS 和 HuoA 扩增的片段中在 5’→3’ 方向第 56 位的碱基 G。 4 4.1 分子鉴定技术 仪器设备及试剂 仪器设备及试剂见附录A。 4.2 溶液配制 1 DB34/T 3244—2018 溶液配制方法见附录B。 4.3 引物 通用引物 TY2s：5’- CGCCATATTGATTGACACG -3’ 通用引物 TY2a：5’- GGCAGCCAACGAGAAGA -3’ 特异性引物 CP2s：5’- TTCGTGGGATGGGGTTC -3’ 特异性引物 CP2a：5’- TGCACATCCGAGCCTGA -3’ 特异性引物 HuoS：5’- AAAAGGGATAGGTGC -3’ 特异性引物 HuoA：5’- GATTTGGGTTGTGATT -3’ 4.4 操作程序 4.4.1 4.4.1.1 4.4.1.2 4.4.1.3 4.4.2 4.4.2.1 DNA 提取 取干燥样品 50 mg 或新鲜样品 100 mg。用 CTAB 法提取总 DNA。具体过程详见附录 C。 所获 DNA 质量能够符合 PCR 扩增需要的 DNA 提取方法都适用于本标准。 样品应符合 DB34/T 486 的规定。 PCR 扩增 反应体系 反应体系总体积为 25 µL，反应组分配制如下。 ——DNA 模板 0.5 µL（5- 50 ng），上游引物 1 µL（10 pmol），下游引物 1 µL（10 pmol）， 10×PCR Buffer 2.5 µL，MgCl2（25 mM）1.5 µL，dNTPs（10 mM）0.5 µL，Taq DNA 聚合酶 （5 U/µL） 0.5 µL，ddH2O 补足至 25 µL。 4.4.2.2 反应程序 反应程序可根据引物不同选下列程序中的一种。 ——程序 1：95℃ 5 min、35 个循环（每个循环包括 95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s）、72℃ 10 min。所用引物为通用引物 TY2s 和 TY2s。 ——程序 2：95℃ 5 min、45 个循环（每个循环包括 95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s）、72℃ 10 min。所用引物为特异性引物 CP2s 和 CP2a。 ——程序 3：95℃ 5 min、35 个循环（每个循环包括 95℃ 30 s，46℃ 30 s，72℃ 30 s）、72℃ 10 min。所用引物为特异性引物 HuoS 和 HuoA。 4.4.3 模板 DNA 质量验证 反应程序1 结束后，分别取 5 µL 扩增反应产物，经琼脂糖凝胶电泳，在全自动凝胶成像分析仪 中观察并拍照。实验中设置无模板 DNA 的空白对照、阴性对照和阳性对照。 实验重复 3 次。 4.4.4 PCR 产物检测 反应程序2 结束后，分别取 5 µL 扩增反应产物，经琼脂糖凝胶电泳，在全自动凝胶成像分析仪 中观察并拍照。实验中设置无模板 DNA 的空白对照、阴性对照和阳性对照。 实验重复 3 次。 2 DB34/T 3244—2018 4.4.5 测序鉴定 对反应程序3 的扩增产物进行测序，每个样本重复测序 3 次。 4.5 数据采集 4.5.1 模板 DNA 质量验证 能扩增出 DNA 条带的数据记录为 1；不能扩增出 DNA 条带的数据记录为 0。 4.5.2 PCR 产物检测 能扩增出 DNA 条带的数据记录为 1；不能扩增出 DNA 条带的数据记录为 0。 4.5.3 测序鉴定 特异性引物 HuoS 和 HuoA 的 PCR 产物经测序后，长度为 171bp，并在其 5’→3’方向第 56 位 为 G（和标准物种的特异性序列相同）的数据记录为 1；第 56 位不为 G 的数据记录为 0。 4.6 判定标准 4.6.1 模板 DNA 质量验证 如果数据记录为 1，判定为该样品的 DNA 质量合格，能用于后续实验；如果数据记录为 0，判定 为该样品的 DNA 质量不合格，不能用于后续实验。 4.6.2 PCR 产物检测 如果数据记录为 1，则所述待测样品中含有霍山石斛或细茎石斛，需要对样品进行测序检测；如果 数据记录为 0，则所述待测样品中不含有霍山石斛。 4.6.3 测序鉴定 如果数据记录为 1，则所述待测样品中含有霍山石斛；如果数据记录为 0，则所述待测样品中不含 霍山石斛。 5 资料记录和档案管理 5.1 资料记录 霍山石斛分子鉴定中的 DNA 质量检测数据、PCR 产物检测数据和测序检测数据等均应作详细的记 录。 5.2 档案管理 所有霍山石斛分子鉴定资料均须建立档案并由专人保管，长期保存。 3 DB34/T 3244—2018 AA 附 录 A （规范性附录） 仪器设备及试剂 A.1 仪器设备 A.1.1 A.1.2 A.1.3 A.1.4 A.1.5 A.1.6 A.1.7 A.1.8 A.1.9 A.1.10 A.1.11 A.1.12 A.1.13 A.2 试剂 A.2.1 A.2.2 A.2.3 A.2.4 A.2.5 A.2.6 A.2.7 A.2.8 A.2.9 A.2.10 A.2.11 A.2.12 A.2.13 A.2.14 A.2.15 A.2.16 A.2.17 A.2.18 A.2.19 4 PCR 扩增仪。 电泳仪。 电子天平。 微量移液器。 微波炉。 高压灭菌锅。 pH 酸度计。 台式高速离心机。 制冰机。 凝胶成像系统或紫外透射仪。 水浴锅或金属浴。 冰箱。 紫外分光光度计。 乙二胺四乙酸二钠。 Tris 碱。 浓盐酸。 氢氧化钠。 Taq DNA 聚合酶 Buffer:含Mg2+。 四种脱氧核苷酸（dNTPs）。 Taq DNA 聚合酶。 特异性引物。 通用引物。 溴酚蓝。 二甲苯氰（FF） 甘油。 硼酸。 无水乙醇。 冰醋酸。 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）。 聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 。 氯仿。 异戊醇。 DB34/T 3244—2018 A.2.20 A.2.21 A.2.22 A.2.23 A.2.24 异丙醇。 RNA 酶。 琼脂糖。 液氮。 DNA 分子标准-600(DNA Marker)。 5 DB34/T 3244—2018 BB 附 录 B （规范性附录） 溶液配制 B.1 DNA 提取溶液的配制 B.1.1 0.5 mol/L EDTA 溶液 称取 186.1 g Na2EDTA·2H2O 溶于 800 mL 水中，用固体 NaOH 调 pH 至 8.0，定容至 1000 mL， 高压灭菌。 B.1.2 1 mol/L Tris-HCl 溶液 称取 60.55 g Tris 碱溶于适量水中，加 HCl 调 pH 至 8.0，定容至 500 mL，高压灭菌。 B.1.3 0.5 mol/L HCl溶液 量取 25 mL 浓盐酸，加水定容至 500 mL。 B.1.4 2％ CTAB 分别称取 CTAB 20 g，NaCl 81.816 g，PVP 20 g，分别量取 1 mol/L Tris-HCl溶液（pH8.0）100 mL，0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）40 mL，定容至 1000 mL。 B.1.5 5 mol/L NaCl溶于水中，加水定容至 500 mL。 B.1.6 氯仿—异戊醇（24: 1） 分别量取 240 mL 氯仿和 10 mL 异戊醇，将两者混匀。 B.2 PCR 扩增溶液的配制 B.2.1 特异性引物和通用引物 用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均为 10 µmol/L 的储存液，各量取 10 µL 混合。 注：干粉配制前应首先快速离心。 B.2.2 6×凝胶加样缓冲液 分别称取 25 mg 溴酚蓝和 25 mg 二甲苯氰 FF，置于 15 ml 塑料离心管中；向离心管中加 6 ml 去离子水，充分搅拌溶解；加入 3 ml 甘油混匀，最终用去离子水定容至 10 ml，4℃保存。 B.3 琼脂糖凝胶电泳溶液的配制 B.3.1 10×TBE缓冲液 分别称取 Tris 碱 108 g，硼酸 55 g，量取 0.5 mol/L EDTA 溶液 37 mL，定容至 1000 mL。 6