ICS 11.220 B 42 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 2894—2018 动物尿液中苯乙醇胺 A 的测定 酶联免疫吸附法 2018 - 12 - 13 发布 河北省市场监督管理局 2018 - 12 - 31 实施 发 布 DB13/T 2894—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由河北省农业厅提出。 本标准起草单位：河北省科学院生物研究所、河北省兽药监察所、石家庄市畜产品质量监测中心。 本标准主要起草人：李春生、米振杰、李云、刘静静、赵义良、杜顺丰、吴萌、王振来、张静。 I DB13/T 2894—2018 动物尿液中苯乙醇胺 A 的测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了动物尿液中苯乙醇胺A的测定 酶联免疫吸附法的原理、试剂和材料、仪器和设备、 样品处理、测定、结果计算、检出限、准确度、精密度、确证试验等要求。 本标准适用于动物尿液中苯乙醇胺A的快速筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规则和试验方法 GB/T 33411 酶联免疫分析试剂盒通则 NY/T 3146 动物尿液中22种β-受体激动剂的测定 液相色谱-串联质谱法 3 原理 采用酶联免疫吸附法，在微孔条上包被偶联抗原，样本中的苯乙醇胺A与酶标板上的偶联抗原竞争 苯乙醇胺A抗体，加酶标记的抗体后，显色剂显色，终止液终止反应。用酶标仪在450 nm处测定吸光度， 吸光度值与苯乙醇胺A含量成负相关，与标准曲线比较即可得出苯乙醇胺A含量。 4 试剂和材料 以下所有的试剂，除特别注明外均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的二级水。 4.1 苯乙醇胺 A 酶联免疫吸附法试剂盒：应符合 GB/T 33411 的规定，组成见附录 A。 4.2 乙酸铵。 4.3 乙酸。 4.4 氢氧化钠。 4.5 乙酸乙酯。 4.6 氯化钠。 4.7 β -盐酸葡萄糖醛苷酶。 4.8 芳基硫酸酯酶。 4.9 苯乙醇胺 A 标准品。 1 DB13/T 2894—2018 4.10 乙酸铵缓冲液 (2 mol/L) ：称取乙酸铵 15.4 g，溶解于 1000 mL 水中，用适量乙酸调 pH 至 5.2。 4.11 氢氧化钠溶液 (5 mol/L)：称取氢氧化钠 2 g，溶解于 10 mL 水中。 4.12 β -盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶：β -盐酸葡萄糖醛苷酶活性约 30 U/mL；芳基硫酸酯酶活 性约 60 U/mL。 5 仪器和设备 5.1 分析天平：感量 0.1 g。 5.2 酶标仪：配备 450 nm 滤光片。 5.3 离心机：10 000 rpm。 5.4 旋涡混合器。 5.5 恒温箱。 5.6 电热恒温振荡水槽。 5.7 氮吹仪。 5.8 pH 计。 5.9 微量移液器：50 μ L，100 μ L，200 μ L，1 000 μ L。 5.10 八道移液器：250 μ L。 6 样品处理 6.1 样品制备 动物尿液试样使用前放置室温，如有混浊，离心后取上清液备用，4℃保存。 6.2 酶解 准确量取5.0 mL试样（6.1）于50 mL离心管，加入乙酸铵缓冲液（4.10）0.5 mL，再加入β-盐酸葡 萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（4.12）50 μL，旋涡混匀，于37℃下避光水浴振荡16 h。 6.3 提取 酶解后，用氢氧化钠溶液（4.11）调pH至9.8±0.2，加入乙酸乙酯（4.5）10 mL，再加入固体氯 化钠（4.6）1.5 g～2 g饱和水相，旋涡混匀，10 000 rpm离心5 min，取上清液于另一50 mL离心管内。 再用乙酸乙酯10 mL重复提取一次。合并上清液，50℃下氮气吹干，用乙酸铵溶液（4.10）5 mL溶解。 取100 μL定容液加入200 μL样本稀释液，混匀后备用。 7 测定 7.1 使用前将试剂盒在室温下回温 1 h～2 h，将所需的酶标板条插入板架中。 2 DB13/T 2894—2018 7.2 每孔依次加标准品或试样 50 μ L，再加抗体工作液 50 μ L，轻轻振荡混匀。用盖板膜盖板，置 37 ℃下反应 45 min。 7.3 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，完全除去孔中的液体，每孔加 250 μ L 洗涤液， 5 s 后倒掉孔中液体，拍干，重复洗涤三遍。 7.4 每孔加酶标记抗体工作液 100 μ L。用盖板膜盖板，置 37 ℃下反应 30 min，重复 7.3。 7.5 底物液 A 液和 B 液按体积比 1︰1 混匀后，每孔加 100 μ L，37℃下避光显色 15 min。 7.6 每孔加终止液 50 μ L，轻轻振荡混匀，放入酶标仪，450 nm 波长测定吸光度值。 8 结果计算 按公式（1）计算百分吸光度比值： Y B 100% …………………………………………………（1） B0 式中： Y——百分吸光度比值； B——标准溶液或试样溶液的平均吸光度值； B0——空白（零浓度的标准溶液）的平均吸光度值。 以百分吸光度比值为纵坐标，以苯乙醇胺A标准品浓度（μ g/L）的对数（lg）为横坐标，绘制标 准曲线。将试样的百分吸光度比值代入标准曲线，计算出溶液的浓度，试样中苯乙醇胺A的浓度（μ g/L） 按照公式（2）计算。 X cV1 N ……………………………………………………（2） V 式中： X——试样中的苯乙醇胺A的含量，单位为微克每升（μg/L）； c——从标准曲线上得到的待测溶液中苯乙醇胺A的浓度，单位为微克每升（μg/L）； V1——试样提取溶液体积，单位为毫升（mL）； N——试样稀释倍数； V——试样的体积，单位为毫升（mL）。 9 检出限、准确度、精密度 9.1 检出限 本方法的检出限为0.2 μg/L。 9.2 准确度 本方法在0.2 μ g/L～2 μ g/L添加浓度水平上的回收率为80 %～120 %。 9.3 精密度 本方法在0.2 μ g/L～2 μ g/L浓度范围的添加回收实验，批内变异系数应≤20 %。 3 DB13/T 2894—2018 10 确证试验 如被测样品中检出苯乙醇胺A时，需要用质谱方法进行确证。 4 DB13/T 2894—2018 附 录 A （资料性附录） 苯乙醇胺 A 酶联免疫吸附法试剂盒组成 A.1 酶标板：规格为 12 条×8 孔。 A.2 苯乙醇胺 A 系列标准溶液：0 μ g/L、0.1 μ g/L、0.3 μ g/L、0.9 μ g/L、2.7 μ g/L、8.1 μ g/L。 A.3 抗体工作液。 A.4 酶标记抗体工作液。 A.5 浓缩样本稀释液：使用前按说明书配制。 A.6 浓缩洗涤液：使用前按说明书配制。 A.7 底物液 A 液。 A.8 底物液 B 液。 A.9 终止液。 5