ICS 71.040.01 A 43 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3116—2018 葡寡糖含量的检测 液相色谱法 Determination method for glucan oligosaccharides—Liquid chromatography method 2019 - 02 - 28 发布 辽宁省市场监督管理局 2019 - 03 - 28 实施 发 布 DB21/T 3116—2018 前 言 本标准是依据 GB/T 1.1—2009《标准化工作导则第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则起草 的。 本标准由大连市质量技术监督局提出。 本标准由中国科学院沈阳分院归口。 本标准起草单位：中国科学院大连化学物理研究所。 本标准主要起草人：陈玮、尹恒。 I DB21/T 3116—2018 葡寡糖含量的检测--液相色谱法 1 范围 本标准规定了葡寡糖含量检测的术语和定义、原理、仪器设备、操作步骤、结果表示和重复性。 本标准适用于以酵母细胞壁、真菌、褐藻、地衣、谷物以及其热凝胶等聚糖为原料，经加工制成的 的葡寡糖产品中β-1,3-葡寡糖（聚合度2-6）含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 葡寡糖 葡聚糖在酸水解或生物酶水解条件下降解为聚合度为2～6的线性低聚糖。 3.2 葡寡糖含量 葡寡糖产品中β-1,3-葡寡糖（聚合度2-6）的质量百分比。 4 原理 葡寡糖经过色谱柱分离后可得到多个单一聚合度的寡糖组分，分离后的葡寡糖组分进入检测器进行 检测，在一定浓度范围内，检测信号的强度与葡寡糖浓度呈线性关系。通过外标法测定并计算得到葡寡 糖产品中不同聚合度葡寡糖组分的浓度和质量。不同聚合度葡寡糖的质量总和与其产品总质量比值的百 分比结果，即为葡寡糖的含量。 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪：配有脉冲式安培检测器（PAD, pulsed amperometric detector）。 5.2 分析天平：感应量为 0.0001 g。 5.3 滤膜：聚四氟乙烯膜，0.2 μm。 1 DB21/T 3116—2018 6 试剂和材料 6.1 水：符合 GB/T 6682 规定的一级水的规定，即电导率（25℃）/（mS/m）≤0.01； 6.2 氢氧化钠溶液（ω(NaOH) =50%）：色谱纯。 6.3 三水乙酸钠：色谱纯。 6.4 100 mmol/L 氢氧化钠溶液：量取 5.23 mL 氢氧化钠溶液（6.2），用水定容至 1000 mL。 6.5 800 mmol/L 三水乙酸钠/100 mmol/L 氢氧化钠溶液：称取 108.86 g 三水乙酸钠，用水（6.1）溶 解后加入 5.23 mL 氢氧化钠溶液（6.2），再用水（6.1）定容至 1000 mL。 6.6 葡寡糖标准品：昆布二糖，纯度≥95 %，昆布三糖，纯度≥95 %；昆布四糖，纯度≥95 %；昆布五 糖，纯度≥90 %；昆布六糖，纯度≥90 %；结构式参见附录 A。 7 测定步骤 7.1 标样溶液的配置 7.1.1 标样溶液 A：分别称取 10.00 mg 经 105 ℃干燥至恒重的 5 种葡寡糖标准品 (6.6)于 50 mL 烧杯 中，加入 20 mL 水（6.1），振荡使其充分溶解，转移至 100 mL 容量瓶中，用水（6.1）定容至刻度， 葡寡糖浓度为 100 µg/mL。 7.1.2 标样溶液 B：吸取 10.00 mL 标准溶液 A 转移至 100 mL 容量瓶中，用水（6.1）定容至刻度，葡 寡糖浓度为 10 µg/mL。 7.1.3 标样溶液 C：吸取 10.00 mL 标准溶液 B 转移至 100 mL 容量瓶中，用水（6.1）定容至刻度，葡 寡糖浓度为 1 µg/mL。 7.2 样品溶液的制备 当样品是颗粒状态时，应先将其在研钵中研细成粉末。 将粉末状样品在105 ℃干燥至恒重。称取25.0 mg样品于50 mL烧杯中，加入20 mL水（6.1），振荡 使其充分溶解，转移至100 mL容量瓶中，用水（6.1）定容至刻度，摇匀。用液相色谱仪测定前，样品 溶液用0.2 μm滤膜过滤。 7.3 检测条件 需满足如下色谱条件： a) 流动相 A：100 mmol/L 氢氧化钠溶液（6.4）； b) 流动相 B：800 mmol/L 三水乙酸钠/100 mmol/L 氢氧化钠溶液（6.5）； c) 色谱柱：离子交换色谱柱，粒径 5 µm，柱长 250 mm，内径 4.6 mm； d) 柱温：30 ℃； e) 流速：1.0 mL/min； f) 进样体积：10 µL。 g) 洗脱方式：梯度洗脱： 0-1 min：0% 流动相 B； 1-30 min：0% -37.5% 流动相 B； 30-35 min: 37.5% -62.5% 流动相 B； 35-40 min: 62.5% -0% 流动相 B。 7.4 分析步骤 2 DB21/T 3116—2018 7.4.1 标准曲线绘制 在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，将标样溶液A（7.1.1）、标样溶液B（7.1.2）、标样溶液 C（7.1.3）进样10 µL。标准溶液的典型色谱图参见附录B。 根据已知标样含量与检测器响应值建立线性方程： Y  aX  b ....................................... (1) 式中： a\b—已知系数； X—溶液中葡寡糖的浓度值（µg/mL）； Y—溶液中葡寡糖的色谱峰面积。 7.4.2 样品测定 在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，将样品溶液（7.2）连续进样3次，进样体积10 µL，得到 样品中不同聚合度葡寡糖峰面积Yi。 8 结果的计算 8.1 葡寡糖的浓度计算 将样品检测响应值代入公式（1），计算得到不同聚合度葡寡糖浓度Xi。 8.2 葡寡糖的含量计算 Wi  Xi  100  Vs  100 ............................. (2) m  1000 式中： Xi —样品溶液中葡寡糖的浓度值（µg/mL） ； m —样品的质量，单位为毫克（mg）； Vs—样品稀释倍数； Wi—样品中葡寡糖的含量，%； 9 重复性 在同一实验室由同一操作人员完成的三个平行测定结果，相对标准偏差不大于5 %；以三次平行测 定结果的算术平均值为测定结果。 3 DB21/T 3116—2018 AA 附 录 A （资料性附录） β-1,3-葡寡糖的化学结构式 图A.1 葡寡糖的化学结构式（n=1,2,3,4） 4 DB21/T 3116—2018 BB 附 录 B （资料性附录） 标准溶液的典型液相色谱图 图B.1 标准溶液的典型液相色谱图 （1-昆布二糖，2-昆布三糖，3-昆布四糖，4-昆布五糖，5-昆布六糖） _________________________________ 5