ICS 11.220 B 41 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3054—2018 犬巴贝斯虫荧光定量 PCR 检测方法 Detection of fluorescent quantitation PCR for Babesia canis 2018 - 10 - 30 发布 辽宁省市场监督管理局 2018 - 11 - 30 实施 发 布 DB21/T 3054—2018 目 前 次 言 ..............................................................................II 1 范围 ................................................................................1 2 规范性引用文件 ......................................................................1 3 缩略语 ..............................................................................1 4 原理 ................................................................................1 5 仪器和器材 ..........................................................................1 6 试剂和引物 ..........................................................................2 7 样品的采集和前处理 ..................................................................2 8 操作步骤 ............................................................................2 9 检测过程中防止交叉污染的措施 ........................................................3 10 废弃物处理 .........................................................................4 I DB21/T 3054—2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本标准主要起草人：高志峰、张才、杨国丽、邓文超、张健、马建山、高原、兰德松。 II DB21/T 3054—2018 犬巴贝斯虫荧光定量 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了犬巴贝斯虫的荧光定量PCR检测方法的技术要求，包含规范性引用文件、缩略语、原 理、仪器和器材、试剂和引物、样品的采集和前处理、操作步骤、检测过程中防治交叉污染的措施、废 弃物处理等。 本标准适用于在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行全血液样品中犬巴贝斯虫核酸的检测， 适用于犬巴贝斯虫病的确诊及流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 中华人民共和国农业部公告2003年第302号《兽医实验室生物安全技术管理规范》 中华人民共和国农业部公告2017年第25号 《病死及病害动物无害化处理技术规范》 3 缩略语 该部分对本技术规范中用到的缩略语进行了注解： DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） bp：碱基对（base pair） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate） Taq酶：Ex Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase） TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Tris acetate-EDTA buffer） 4 原理 巴贝斯虫病是指由巴贝斯科的原虫所引起的一种梨形虫病，主要以侵害家畜的红细胞为特征的血液 原虫病。犬巴贝斯虫病是一种经硬蜱传播的血液原虫病，临床上以严重贫血、高热、黄疸、呼吸困难为 特征。根据犬巴贝斯虫（Babesia cains, B. canis）裂殖子基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化 下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的 子链DNA。 5 仪器和器材 1 DB21/T 3054—2018 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 低温高速离心机（最大离心力 12 000 rpm）. 冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1 ℃冰箱，-70℃±1℃冰箱。 生物安全柜。 荧光 PCR 扩增仪。 分析天平。 离心管：1.5 ml 离心管和 0.2 ml PCR 专用离心管。 微量可调移液器：1000 μl，200 μl，100 μl，50 μl，20 μl，10 μl，2 μl。 6 试剂和引物 注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含RNA或RNase的分 析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。 6.1 5 mMol/L 的 Tris/HCl(pH 7.5～8.0) 6.2 灭菌双蒸水 6.3 70%乙醇 6.4 犬巴贝斯虫阳性对照组基因 6.5 特异性引物： 正向引物：5’- TGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAG TTG-3’ 反向引物：5’- TCCATGCTGAAGTATTCAAGA CACA-3’。 6.6 基因组 DNA 纯化试剂盒 100 次、购自 TaKaRa 公司，常温保存 6.7 荧光定量试剂盒FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)。产品在-15至-25℃条件下可稳定 存放至标签上的有效期之前。若存放于2～8℃条件 ，仅可短期储存不超过1个月。 7 样品的采集和前处理 7.1 于犬前肢臂头静脉取300 µl抗凝血，4℃保存，4h内使用全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA。将 获得的DNA放置﹣20℃保存。 7.2 采样时避免接触血液，尽量使用一次性采血针及配套采血管（EDTA，2Na-EDTA，肝素均可）采血。 7.3 采集或处理的样品在2～8℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避 免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6～8 h之内运送 到实验室。 7.4 按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。 8 操作步骤 8.1 全血基因组的提取 8.1.1 按处理血液样品数准备1.5 ml离心管，并各加入 GenTLE Solution I 500μl。 8.1.2 把混合均匀的100 μl血液，加入到分装好的 GenTLE Solution I 的离心管中，立即振荡数秒钟。 不管处理多少样品，血液加入到 GenTLE Solution I 中，要立即进行振荡混合，否则有可能降低收取 的DNA量。 2 DB21/T 3054—2018 8.1.3 室温放置 10 min以上，然后在室温条件下12 000 rpm离心5min。离心时，请注意离心管在离心 机里的摆放方向要统一，离心管的小耳朵朝上。此时几乎看不到DNA沉淀。若离心温度低，会对收取的 DNA量和纯度有影响，请于20℃以上离心。 8.1.4 用移液器小心除去管中溶液，此时沉淀看不清，紧贴在离心管外侧（带小耳朵一侧）的内壁上， 除去溶液时，请一定注意微量移液器吸头不要碰到离心管外侧的内壁，插到离心管内侧的底部，注意不 要吸走沉淀物。 8.1.5 加入1 ml的 GenTLE Solution II。此时 GenTLE Solution II 应沿着离心管内侧的内壁加入到 离心管中。特别注意操作步骤4（除去 GenTlE Solution I 和血液混合物）以及操作步骤10（除去 GenTLE Solution III 和异丙醇混合物）的实验操作特别重要，请严格按操作方法进行。 8.1.6 轻柔地上下颠倒离心管数次，室温12 000 rpm 以上离心2min，用微量移液器小心地除去上清溶 液（方法参见实验操作4）。剧烈振荡将影响收量和纯度。 8.1.7 向离心管中加入 GenTLE Solution III 500μl，轻微振荡 10 s 充分混合。 8.1.8 室温12 000rpm离心5min，把上清溶液移至另一个新的离心管中。 8.1.9 加入等体积（约500μl）的异丙醇，轻柔地上下颠倒数次，均匀混合。 8.1.10 4℃、12 000 rpm 离心 5 min，小心除去上清溶液。 GenTLE Solution III 中含有影响酶反应 的物质，所以一定要除净上清溶液，但应注意不要吸走沉淀。 8.1.11 加入1 ml的70%乙醇清洗沉淀，4℃、12 000 rpm 离心5min，小心地除去上清溶液（方法参见4）。 8.1.12 干燥沉淀。因为该方法提取的DNA较大，完整性好，所以请一定不要干燥过度。Tube（离心管） 中看不到有明显的液体或没有乙醇气味后，就可以加入TE进行溶解。如果沉淀已经变白，说明干燥过度， 此时加入TE，可能沉淀不能完全溶解，DNA的收量可能会受到影响。 8.1.13根据下一步实验需要，用 10～50 μl 适当的5 mMol/L 的Tris/HCl(pH 7.5～8.0)溶解沉淀。 8.2 荧光定量 PCR 的方法 8.2.1 冰上操作。 8.2.2 准备0.2 ml Tube若干（数目为样品数目+2）。 8.2.3 向每个管中加入 （1）2×SYBR Master Mix 10.0 µl； （2）20 µmol/l正反向引物各0.1 µl； （3）去离子水7.8 µl； （4）样品2 µl，其中2个管分别加入2µl灭菌双蒸水和2µl阳性对照基因。 8.