ICS 67.120.30 B 51 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB13/T 2746—2018 西伯利亚鲟种质鉴定规范 2018 - 07 - 16 发布 河北省质量技术监督局 2018 - 08 - 16 实施 发 布 DB13/T 2746—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北省农业厅提出。 本标准起草单位：河北省海洋与水产科学研究院、河北农业大学海洋学院、保定市水产技术推广 站、曲阳县满鑫鲟鱼繁育养殖有限公司。 本标准主要起草人：肖国华、宫春光、高晓田、任雪莲、张建修、徐荣郅、王东辉、胡志山、殷 蕊、张耀红。 I DB13/T 2746—2018 西伯利亚鲟种质鉴定规范 1 范围 本标准规定了西伯利亚鲟（Acipenser baerii）的学名与分类、生物学特征、生长与繁殖、遗传 学特性、检测方法与检验规则。 本标准适用于西伯利亚鲟的种质检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18654.1 养殖鱼类种质检验 第1部分：检验规则 GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分：抽样方法 GB/T 18654.3 养殖鱼类种质检验 第3部分：性状测定 GB/T 18654.4 养殖鱼类种质检验 第4部分：年龄与生长的测定 GB/T 18654.6 养殖鱼类种质检验 第6部分：繁殖性能的测定 GB/T 18654.13 养殖鱼类种质检验 第13部分：同工酶电泳分析 GB/T 18654.14 养殖鱼类种质检验 第14部分：DNA含量的测定 GB/T 18654.15 养殖鱼类种质检验 第15部分：RAPD分析 3 学名与分类 3.1 学名 西伯利亚鲟（Acipenser baerii）。 3.2 分类地位 属鲟形目（Acipenseriformes）, 鲟科（Acipenseridae）,鲟属(Acipenser)。 4 生物学特征 4.1 外部形态 鱼体修长，呈纺锤形，横切呈五角形，向尾部延伸变细，吻长尖，口腹位，口裂较小，一字形。 歪形尾，鳃盖骨愈合为一,鳃盖膜彼此不相连而与颊部相连。体裸露无鳞具5列骨板，1列背骨板，2列 侧骨板，2列腹骨板；第一背骨板不是最大的骨板,身体最高点不在第一骨板处；侧骨板通常与躯干部 颜色相似；腹骨板与背骨板间具有许多星状薄骨板或微小颗粒，吻须4根，介于吻突与口裂之间，稍靠 近口裂。鳃耙有结节，一般为3个。鱼体背部呈淡灰黑色或暗褐色，两侧较淡，腹部为白色。 西伯利亚鲟的外部形态见图1。 1 DB13/T 2746—2018 图1 西伯利亚鲟外形 4.2 可数性状 背鳍鳍式：D.30～56。 臀鳍鳍式：A.17～33。 背骨板数：10～20。 侧骨板数：37～56，通常为42～47。 腹骨板数：7～16。 第一鳃弓（左）外侧鳃耙数：20～49，通常为27～32。 4.3 可量性状比例 西伯利亚鲟可量性状比例见表1。 表1 西伯利亚鲟的可量性状比例（平均值±标准差） 指 标 项 目 8 月龄鱼 3 龄鱼 10 龄鱼 全长/体长 a 1.31±0.04 1.25±0.06 1.28±0.04 体长/体高 6.65±0.64 6.15±0.04 5.53±0.51 体长/头长 3.69±0.25 3.79±0.34 4.09±0.28 头长/吻长 1.74±0.17 2.09±0.18 2.09±0.17 头长/眼径 22.13±1.97 23.52±6.72 23.70±4.21 头长/眼间距 3.59±0.48 3.17±0.39 3.29±0.30 头长/尾柄高 8.47±1.23 6.39±1.51 5.75±1.01 尾柄长/尾柄高 2.84±0.64 2.28±0.57 2.5±0.52 a 采用从吻端到尾鳍基部的长度 5 生长与繁殖 5.1 生长 在人工养殖条件下，不同年龄组的西伯利亚鲟鱼体长和体重范围见表2。 2 DB13/T 2746—2018 表2 西伯利亚鲟各年龄组体长和体重范围 指标 项目 1 龄鱼 2 龄鱼 3 龄鱼 4 龄鱼 5 龄鱼 体长（cm） 40～50 50～70 70～85 90～100 100～120 体重（g） 400～600 1500～2000 3000～4000 5000～7000 7000～9000 a 依据北方地区流水养殖模式，年龄以周年计 5.2 繁殖 性成熟年龄：自然条件下雌鱼为19龄～20龄，雄鱼为17龄～18龄；人工养殖条件下雌鱼为7龄以上， 雄鱼为5龄以上。繁殖周期：野生状态下为2年以上；人工养殖条件下为1年以上。怀卵量占体重的10%～ 30%。 6 遗传学特征 6.1 西伯利亚鲟 DNA 含量 西伯利亚鲟细胞中DNA含量为N=8.98±0.115 pg。 6.2 生化遗传学特征 西伯利亚鲟肝脏酯酶（EST）同工酶有6条酶带，电泳图及酶带电泳模式图见图2。 1-电泳图谱， 2-模式图 图2 西伯利亚鲟肝脏酯酶电泳图谱及模式图 6.3 分子遗传学标记 6.3.1 西伯利亚鲟特异性 RAPD 遗传图谱的建立及特征标记 RAPD引物（CCGCCCAAAC）PCR扩增的结果如图3所示。 3 DB13/T 2746—2018 1-西伯利亚鲟池， 2、3-西伯利亚鲟个体， 4-marker 图3 RAPD 引物的扩增产物 6.3.2 西伯利亚鲟微卫星 DNA 分子标记的建立 采用14对微卫星引物进行基因型鉴定，西伯利亚鲟在这14对引物的等位基因长度范围见表3。基因 型数据分析结果见图4。 表3 14 个微卫星引物序列及其在西伯利亚鲟的等位基因长度范围 位点名称 引物序列 等位基因长度范围 (5’-3’) (bp) Atr-1101 F：TATCCCCTCCACTGGAAAT R：GTTAAACATCCCTGCCTTCA 143～203 Atr-105 F:CGATTTGATTGGCTCTTGTA R:TGCAAATAAATTGGAGCTGA 157～173 Atr-107 F:GGCAGGATTACATCTCCTGA R:TTACTAACTGCTAGATAATACCTCTCT 188～242 Atr-109 F:ACCCGAGCTGTCACATTACT R: AAAATAACGCGAATTCCTGA 162～300 Atr-114 F:GCAATTCGTGTTATGTTCATTT R: TGCATTCAGAGAATAACCGA 201～251 Atr-117 F:TGCATGACACAGGACTTACC R: TGCCTCTCAATAGCAACATC 191～259 Abr39 F:ACCCGCAATTATTAGGAC R: CAGGACAAACTCAGACCC 178～276 Abr40 F:TCACGCAGTCTCACAAGG R: TTCAATGGCAAACAGCAC 384～418 Abr41 F:ACACTATCCCGCCACAAT R: CCACTGAAGCCATCATCT 322～410 Afu19 F:CATCTTAGCCGTCTGTGGTAC R: CAGGTCCCTAATACAATGGC 120～139 Afu22 F:TCCACAATCCTGAATAATGAC R: GCACCATCTAATACGAAATTG 140～242 Afu39 F:TTCTGAAGTTCACACATTG R: ATGGAGCATATTGGAAGG 119～140 Afu54 F:CTCTAGTCTTTGTTGATTACAG R: CAAAGGACTTGAAACTAGG 149～221 Afu68 F:TTATTGCATGGTGTAGCTAAAC R: AGCCCAACACAGACAATATC 128～250 4 DB13/T 2746—2018 1、 西伯利亚鲟品种池， 2、 非西比利亚鲟样品。 图4 微卫星标记基因型数据分析结果图 7 检测方法 7.1 抽样方法 按GB/T 18654.2执行。 7.2 性状检测 按GB/T 18654.3执行。 7.3 年龄与生长测定 按GB/T 18654.4执行。 7.4 繁殖性能测定 按GB/T 18654.6执行。 7.5 DNA 含量测定 按GB/T 18654.14执行。 7.6 同工酶测定 样品制备、电泳分析按GB/T 18654.13执行。 7.7 分子遗传学标记方法 7.7.1 DNA 的提取 DNA的提取按GB/T 18654.15执行。 7.7.2 PCR 扩增反应 2+ 扩增反应总体积为25 µL，其中包括摸板DNA30 ng、10×PCR缓冲液（含Mg ）2.5 µL、d NTPS（2.5m Meach）2 µL、Taq酶（5 u/µL）0.3 µL、引物1 p M（RAPD法和微卫星DNA法分别使用各自的引物）。 RAPD法反应程序为：95℃预变性5 min，94℃ 45 s、36℃ 45 s、72℃ 90 s，45cycles，72℃延 伸5 min。 5 DB13/T 2746—2018 微卫星DNA法反应程序为：94℃变性45 s、退火45 s（各引物退火温度详见表4）、72℃延伸45 s， 40cycles，72℃再延伸5 min。 扩增反应结束后，取5 µL产物与1 µL上样缓冲液混合点样，在含溴化乙锭的1.4%琼脂糖凝胶中电 泳1 h～2 h，电压80 v，紫外灯下观察结果并拍照记录。 表4 14个微卫星位点重复序列结构和退火温度 位点名称 重复序列结构 退火温度（℃） Atr-1101 (TATC)10 55 Atr-105 (GATA)15 50 Atr-107 (TAGA)17 57 Atr-109 (GA)5(TAGA)20 55 Atr-114 (TAGA)23 60 Atr-117 (GATA)8 55 Abr 39 (TATC)18 58 Abr 40 (TCTA)6(TAGA)12 61 Abr 41 (TCTA)17 65 Afu19 (TTG)5 53 Afu22 (TAAA)5(GAA)19 52 Afu39 (CAA)14 55