ICS 13.060 B 21 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3111—2019 水质 肠球菌的测定 固定底物技术酶底物法 Water quality—Determination of Enterococci—Defined substrate technology enzyme substrate method 2019- 02 - 28 发布 辽宁省市场监督管理局 2019- 03 - 28 实施 发 布 DB21/T 3111—2019 目 次 前言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 2 规范性引用文件 .................................................................... 3 术语和定义 ........................................................................ 4 方法原理 .......................................................................... 5 试剂和材料 ........................................................................ 6 仪器和设备 ........................................................................ 7 样品 .............................................................................. 8 分析步骤 .......................................................................... 9 结果计算与表示 .................................................................... 10 精密度和准确度 ................................................................... 11 质量保证和质量控制 ............................................................... 12 废物处理 ......................................................................... 13 注意事项 ......................................................................... 附录 A ............................................................................... 1 1 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 5 6 I DB21/T 3111—2019 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》起草制订。 本标准附录A为规范性附录。 本标准由大连市市场监督管理局提出。 本标准由辽宁省生态环境厅归口。 本标准起草单位：大连市环境监测中心、国家海洋环境监测中心。 本标准主要起草人：王中卫、明红霞、李翔宇、沈学崴、李玉璞、苏洁、曲翊、王琳琳、刘子成、 孙沛雯、刘景泰、韩佳。 II DB21/T 3111—2019 水质 肠球菌的测定 固定底物技术酶底物法 1 范围 本标准规定了测定水中肠球菌的固定底物技术酶底物法。 本标准适用于地表水、地下水、饮用水、海水、生活废水和工业废水中肠球菌的测定。 本标准的检出限：地表水、地下水、饮用水、生活废水、工业废水样品的检出限为1 CFU/100 ml， 海水样品的检出限为10 CFU/100 ml。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 5750.2 生活饮用水标准检验方法 样品的采集与保存 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 17378.7 海洋监测规范 第七部分：近海污染生态调查和生物监测 HJ/T 164 地下水环境监测技术规范 HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 肠球菌 Enterococci 41 ℃培养24 h，能产生β-半乳糖苷酶（β-Ｄ-galactosidase），分解选择性培养基中的4-甲基 伞形酮-β-Ｄ-葡萄糖醛酸苷（4-methyl-umbelliferyl-β-Ｄ-glucoside，MUG）释放出荧光物质（4甲基伞形酮）的革兰氏阳性菌。 3.2 最大可能数 most probable number（MPN） 又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释 度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积 存在目标微生物的最大可能数）。 4 方法原理 1 DB21/T 3111—2019 在特定温度下培养特定的时间，肠球菌能产生β-半乳糖苷酶，分解荧光底物释放出荧光产物，在 366 nm紫外灯照射下产生特征性荧光。统计荧光反应出现数量，查MPN表，计算样品中肠球菌的浓度值。 5 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，符合GB/T 6682 三级标准的蒸馏水或去 离子水。 5.1 培养基 市售Enterolert培养基，也可以使用其他等效产品。 5.2 硫代硫酸钠溶液：ρ（Na2S2O3·5H2O）=0.10 g/ml 称取硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）10.0 g，溶于适量实验用水，定容至100 ml，临用现配。 5.3 乙二胺四乙酸二钠溶液：ρ（C10H14N2O8Na2·2H2O）=0.15 g/ml 称取乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2·2H2O）15.0 g，溶于适量实验用水，定容至 100 ml，此溶液 保质期为 30 d。 5.4 无菌水 实验用水经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。 6 仪器和设备 6.1 恒温培养箱：能够恒温至 41 ℃，控温精度 0.5 ℃。 6.2 高压蒸汽灭菌器：能够加热至 121 ℃。 6.3 紫外灯：台式，366 nm。 6.4 封口机：用于定量盘的封口。 6.5 采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的 250 ml 玻璃瓶。 6.6 三角瓶:100 ml。 6.7 97 孔定量盘。 6.8 一般实验室常用仪器和设备。 2 DB21/T 3111—2019 注：移液管、量筒、采样瓶、三角瓶等玻璃器皿和采样器具应按无菌操作要求包扎，于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min， 烘干，备用。灭菌后的采样瓶，两周内未使用，需重新灭菌。 7 样品 7.1 样品采集与保存 按照 GB/T 5750.2、GB 17378.7、HJ/T 164 和 HJ/T 91 的相关规定进行样品采集。采样后水样应 在 4℃下冷藏保存，6 h 内开始检测。 7.2 干扰和消除 7.2.1 含活性氯（余氯）的水样，在采样瓶灭菌前需加入0.2 ml硫代硫酸钠溶液。 7.2.2 含重金属的水样，在采样瓶灭菌前需加入0.6 ml乙二胺四乙酸二钠溶液。 8 分析步骤 8.1 样品稀释 根据水样污染程度确定稀释度，避免接种水样经培养后出现全部阳性或全部阴性。接种量小于100 ml时，水样应制成稀释样品后使用，接种量为10 ml时，以无菌操作方法取10 ml水样加入到装有90 ml 无菌水的三角瓶（6.6）中混匀制成1:10（稀释度）稀释的样品，其它接种量的稀释样品依次类推。 注：海水样品至少经1:10稀释后再进行检测。 8.2 接种 以无菌操作方法量取100 ml原水样或稀释样品于三角瓶（6.6）中，加入1支培养基（5.1），充分 混匀，完全溶解后，全部倒入97孔定量盘（6.7）内，以手抚平定量盘（6.7）背面，去除孔内气泡，然 后用封口机（6.4）封口。 8.3 培养 将封口后的97孔定量盘（6.7）放入培养箱（6.1）中培养24 h。 8.4 对照试验 8.4.1 空白对照 使用无菌水（5.4）进行实验室空白测定，培养后的97孔定量盘（6.7）不得有荧光产生，否则，该 次样品测定结果无效，应重新测定。 8.4.2 阴性及阳性对照 3 DB21/T 3111—2019 阳性菌株参考使用粪肠球菌（Enterococcus faecalis）,阴性菌株参考使用粘质沙雷氏菌（Serratla marcescens）和绿脓杆菌（Aerococcus viridians）。将菌株配制成 0.5 麦氏浊度的菌悬液按照 8.2 和 8.3 要求操作，阳性菌株应呈阳性反应（有荧光），阴性菌株呈阴性反应（无荧光），否则该批次测 定结果无效，应重新测定。 8.5 结果判读与计数 将培养24 h后的97孔定量盘（6.7）进行结果判读，水样在紫外灯（6.3）照射下有荧光，则判断为 肠球菌阳性。若结果可疑，可延长培养时间到28 h进行结果判读，超过28 h后出现的荧光反应不作为阳 性结果。 9 结果计算与表示 9.1 结果计算 从97孔定量盘法MPN表（附录A）中查得每100 ml水样中肠球菌的MPN值，再根据样品不同的稀释度 进行计算，每100 ml水样中肠球菌的计算公式如下： 式中：C——每100 ml水样中肠球菌浓度，CFU/100 ml； MPN值——查表得到的MPN值，CFU/100 ml； f——接种样品的稀释度。 9.2 结果表示 测定结果保留两位有效数字，大于等于100时以科学计数法表示，结果单位为CFU/100 ml。 10 精密度和准确度 10.1 精密度 多家实验室分别对肠球菌有证标准样品（221±37 CFU/100 ml）和低浓度（5CFU/100 ml）、中浓 度（980CFU/10