ICS 11.020 C 05 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 396.3—2017 代替 DB22/T 396-2014 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 3 部分：长期经皮毒性试验 Toxicological evaluation procedures and test methods for health care products Part 3: Long term percutaneous toxicity test 2017 - 11 - 10 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 12 - 30 实施 发 布 1 DB22/T 396.3—2017 前 言 DB22/T 396《保健用品毒理学评价程序与检验方法》拟分为如下部分： ——第 1 部分：评价程序； ——第 2 部分：急性经皮毒性试验； ——第 3 部分：长期经皮毒性试验； ——第 4 部分：皮肤刺激性试验； ——第 5 部分：皮肤变态反应试验； ——第 6 部分：细菌回复突变试验； ——第 7 部分：啮齿动物微核试验； ——第 8 部分：小鼠精子畸形试验； ——第 9 部分：哺乳动物培养细胞染色体畸变试验； ——第 10 部分：致畸试验； ——第 11 部分：致癌试验； ——第 12 部分：人体皮肤斑贴试验。 本部分为DB22/T 396-2017的第3部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本部分代替DB22/T 396-2014《保健用品毒理学评价程序与检验方法》，与DB22/T 396-2014相比， 结构做了较大调整。除编辑性修改外，主要技术内容变化如下： ——增加了警示 ——增加了范围； ——增加了仪器； ——增加了附录 A。 本部分由吉林省卫生与计划生育委员会提出并归口。 本部分起草单位：吉林省疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：孟令仪、宋昕恬、张晶莹、孙兰、吴晓刚、隋自洁、高峰。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： ——DB22/T 396-2004； ——DB22/T 396-2014。 DB22/T 396.3—2017 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 3 部分：长期经皮毒性试验 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了保健用品毒理学长期经皮毒性试验评价程序。 本标准适用于保健用品毒理学长期经皮毒性试验检验方法。 2 检验方法 2.1 材料 2.1.1 动物 选用成年健康家兔、豚鼠或大鼠。家兔体重2 kg左右；豚鼠300 g左右，大鼠200 g～300 g。受试 动物应皮肤光滑，无损伤。 2.1.2 受试物 如为膏剂或液体剂型，可直接涂抹于去毛皮肤上。若受试物是固体粉末或散剂，则需加适量水或适 当的赋形剂(如羊毛脂、凡士林、橄榄油等〉混匀，以保证受试物与皮肤良好接触。 2.2 仪器 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.3 体重秤：精确到 0.1 kg； 电子天平：精确到 0.1 g； 血液五分类分析仪； 生化分析仪； 显微镜； 病理。 试验方法 2.3.1 剂量和分组 一般设高、低两个剂量组和一个对照组。皮肤给受试物的高剂量组应是使动物产生严重毒性反应或 有少数动物死亡的剂量，低剂量组应当相当或略高于功效学的有效剂量。但如皮肤急性毒性试验剂量超 过临床用量20倍未出现毒性反应及死亡者，可设一个相当于临床20倍以上的高剂量组和一个对照组。每 组应设家兔6只，如用大鼠或豚鼠，每组应设8 只～10 只。 2.3.2 动物皮肤给予受试物方法 DB22/T 396.3—2017 皮肤准备、涂抹受试物和固定方法按2.1.1及2.1.2进行。每周给受试物七次，每日一次，每次至少 接触6 h。实验周期，给受试物时间不少于使用周期的两倍。 2.4 结果判定 2.4.1 观察指标 一般状况和毒性症状有： a) 死亡：死亡是动物最明显的表现，但须注意鉴别确系受试物中毒死亡，而与自然死亡或意外 死亡区别开来。发现死亡动物应立即进行尸检，寻找死亡原因。最好在动物中毒临终前活杀 检查，如在死亡后检查，可能会受死亡后的自溶现象（autolysis）干扰； b) 饲料和饮水量消耗：应每周记录，并与体重变化对照观察； c) 体重变化情况：应每周称量、记录； d) 毒性症状：给受试物后应每天注意有无毒性症状出现，专人负责观察和记录。尤其在给受试 物第一周内，毒性症状出现最多，必须严密观察，及时发现。如一般行为，运动功能，呼吸 的频率和性质，有无腹泻、腹痛、便血、眼、耳、鼻、口腔、外阴部有无异常或分泌物。群 养时应将发现中毒反应的动物及时取出单笼饲养，重点观察。毒性症状有些只在给受试物后 的一定阶段出现，以后逐渐自行消失或减轻；有些则随时间而进行性发展。因此必须列表逐 日或逐周（逐个动物）记录，以便看出症状发生、发展的过程，以及各种症状出现的先后次 序。 给受试物停止后，留下部分（约1/3）动物继续观察2周，观察毒性反应可逆程度，其他动物全部处 死。并作血液学、生化学和病理学检查，但病理组织学检查中，受试物涂抹的局部皮肤应列为检查的一 个重要对象。 2.4.2 血液检查 测定红细胞、白细胞、血红蛋白、白细胞分类、血小板和凝血时间。急性毒性试验未发现明显毒性 者，可简化为测定红、白细胞计数，白细胞分类和血红蛋白含量。 2.4.3 血液生化检查 测定天门冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶、碱性磷酸酶、尿素氮、总蛋白、白蛋白、血糖、 总胆红素、肌酐、总胆固醇。急性毒性试验未发现明显中毒者，至少应测定肝、肾功能各两项敏感指标。 2.4.4 病理检查 系统尸解和病理组织学检查有： a) 系统尸解：复称体重后尸解，观察要全面细致，发现异常的器官应重点进行病理组织学检查； b) 脏器称重和计算脏器系数：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、辜丸、卵巢和可能的靶器 官称重并计算脏器系数。急性毒性试验未发现明显毒性者，至少应测心、肝、脾、肺、肾五 个实质脏器的重量并按式（1）计算脏器系数； k= 式中： 2 m1 ........................................ (1) m2 DB22/T 396.3—2017 式中： k ——脏器系数； m1 ——脏器重量，g； m 2 ——体重，g。 c) 病理组织学检查：取材后立即放进 10 %福尔马林中固定。并根据所含中药的性、味、功效可 先作高剂量组和对照组的组织学检查，其他剂量组可取材 10 %福尔马林中固定保存，在高剂 量组有异常时再进行检查。 2.5 结果评价 长期经皮毒性试验结果应结合前期试验结果，并考虑到毒性效应指标和尸检及病理组织学检查结果 进行综合评价。毒性评价包括受试物染毒剂量与是否出现毒性反应、毒性反应发生率及其程度之间的关 系。这些反应包括行为或临床异常、肉眼可见损伤、靶器官、体重变化情况、死亡效应以及其它一般或 特殊的毒性作用。将各剂量组动物观察指标与阴性对照组加以比较并进行统计学检验，注意各剂量组间 的剂量-反应(效应)关系。评价受试物最小观察到有害作用剂量和最大未观察到有害作用剂量及毒性作 用的靶器官。 A DB22/T 396.3—2017 BA 附 录 A （规范性附录） 实验动物体表面积估算方法 A.1 兔 2 s = k × m 3 ......................................(A.1) 式中： s ——体表面积，cm2； k ——常数，一般成年家兔为 10； m ——动物体重，g。 例：体重 2 kg 成年家兔体表面积： s = 10 × 2000 2 3 2 lg S = lg 10 + lg 2000 3 = 1 + 0.667 × 3.3010 = 1 + 2.2008 = 3.2008 查反对数表：S = 1588cm 2 A.2 豚鼠 2 s = k × m 3 ..................................... (A.2) 式中： s ——体表面积，cm2； k ——常数， k = 9.26 ； m ——动物体重，g。 例:体重 438 g 之豚鼠的体表面积： 2 lg S = lg 9.26 + lg 438 3 2 = 0.9666 + × 0.8805 3 = 0.9666 + 1.7610 = 2.7276 查反对数表：S = 534cm 2 4 DB22/T 396.3—2017 A.3 大鼠、小鼠 2 s = k × m 3 ..................................... (A.3) 式中： s ——体表面积，cm2； k ——常数， k = 0.0913 ； m ——动物体重，g。 例：体重 200 g 大鼠的体表面积： s = 0.0913 × (0.2) 3 2 2 lg S = lg 0.0913 + lg 0.2 3 2 = 2.9605 + × 1.3010 3 = 2.9605 + 1.5340 = 2.1945 查反对数表：S = 3.123cm 2 ______________________