ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2788—2017 猫泛白细胞减少症诊断 实时荧光 PCR 法 The diagnostic of Feline panleukopenia virus Real-time PCR method 2017 - 12 - 11 发布 吉林省质量技术监督局 2018 - 04 - 01 实施 发 布 DB22/T 2788—2017 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院、吉林农业大学、吉林省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：程荣华、呼延含蓉、王开、郭衍冰、王楠、丁世杰、邵洪泽、于钦磊、白翠、 李昱洁、陆伟、何浩、刘沂霖、赵欣、肖玉海、王辉。 I DB22/T 2788—2017 猫泛白细胞减少症诊断 实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了猫泛白细胞减少症实时荧光PCR方法的缩略语、材料、操作步骤和结果判定。 本标准适用于猫泛白细胞减少症的实验室诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） Ct：循环阈值（Cycle threshold） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） 4 材料 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.1.7 4.1.8 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 仪器设备 分析天平，感量 0.1 mg。 高速冷冻离心机，12 000 r/min 以上。 荧光定量 PCR 扩增仪。 冰箱，2 ℃～8 ℃ 和 -20 ℃ 两种。 可调移液器，最大量程为 10 μL，200 μL，1 000 μL。 恒温水浴锅，控温范围为室温至 100 ℃。 高压蒸汽灭菌器。 干热箱。 器械与耗材 组织匀浆器或研钵。 医用剪刀。 医用镊子。 1.5 mL 离心管。 15 mL 离心管。 50 mL 离心管。 1 DB22/T 2788—2017 4.2.7 4.2.8 4.2.9 4.2.10 4.2.11 4.3 1 000 mL 量筒。 1 000 mL 容量瓶。 PCR 八联排管。 吸头，10 μL，200 μL，1 000 μL。 医用棉签。 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 4.3.1 0.02 mmol/L PBS，见附录 A。 4.3.2 基因组 DNA 提取试剂盒。 4.3.3 SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）。 4.3.4 灭菌双蒸水。 4.4 引物 上游引物 F：5'- AATGCTTGGGGAGTTTGGTTT -3'。 下游引物 R：5'- TTTAGTTGGTGGCTGAGTAGCAGA -3'。 5 操作步骤 5.1 采样器具前处理 5.1.1 5.1.2 5.2 组织匀浆器或研钵（4.2.1）、医用剪刀（4.2.2）、镊子（4.2.3）经 160 ℃干热灭菌 2 h 。 离心管经 121 ℃± 2 ℃高压蒸汽灭菌 15 min 。 样品的采集和处理 5.2.1 用拭子（4.2.11）采集猫眼周分泌物、鼻液、粪便，采集样品的拭子用少量 PBS（4.3.1） 浸 润后，3 000 r/min 离心 15 min，取上清液待检。 5.2.2 采集病死猫肠道、肝、脾等组织器官，加等体积 PBS（4.3.1） 研磨匀浆，3 000 r/min 离心 15 min，取上清液待检。 5.3 DNA 提取 按照基因组 DNA 提取试剂盒说明书要求操作，提取的基因组 DNA 应迅速进行荧光定量 PCR 扩增， 或置于 -20 ℃冰箱（4.1.4）备用。 5.4 反应体系 5.4.1 实时荧光 PCR 扩增反应体系见表 1。 表1 实时荧光 PCR 反应体系 试剂 剂量 上游引物 F(10 μmol/L) 1.0 μL 下游引物 R(10 μmol/L) 1.0 μL 待检样品 DNA 2.0 μL 灭菌双蒸水 8.5 μL 2 DB22/T 2788—2017 表 1（续） 试剂 剂量 SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)（2×） 12.5 μL 总体积 25.0 μL 5.4.2 以灭菌双蒸水为阴性对照，以猫泛白细胞减少症病毒基因组 DNA 或含目的片段的阳性质粒为阳 性对照。 5.5 反应程序 实时荧光 PCR 反应程序见表 2。 表2 反应步骤 第一步 第二步 6 实时荧光 PCR 反应程序 温度 时间 循环数 ℃ s 次 95 30 1 95 5 60 30 40 结果判定 6.1 结果分析条件设定 试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct 值直接读取检测结果，Ct 值为每个反应管内的荧光 信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的 最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。 6.2 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.3 质控标准 阴性对照无 Ct 值并且无典型扩增曲线。 阳性对照的 Ct 值应≤35.0，并出现特定的扩增曲线。 如阴性对照和阳性对照不满足以上所有条件，实验结果视为无效。 结果描述及判定 6.3.1 无 Ct 值，无典型的扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为阴性。 6.3.2 Ct 值≤35.0，出现典型的扩增曲线，判为阳性。 6.3.3 35.0＜Ct 值≤40.0，出现特定的扩增曲线，样品判为疑似。应重新采样检测，结果仍为疑似， 判定为阳性。 3 DB22/T 2788—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 磷酸缓冲生理盐水 A.1 A液 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液，称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）71.64 g，先加适量去离子水溶解， 最后定容至 1 000 mL，混匀。 A.2 B液 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液，称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）31.21 g，先加适量去离子水溶解， 最后定容至 1 000 mL，混匀。 A.3 0.02 mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）的配制 量取 0.2 mol/L 的 A 液 360 mL，0.2 mo1/L 的 B 液 140 mL，称取氯化钠 38 g，用去离子水溶 解稀释至 5 000 mL，4 ℃保存。 _________________________________ 4