ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2782—2017 犬瘟热病毒检测 荧光定量 RT-PCR 方法 Detection of canine distemper virus Fluorescence quantitative RT-PCR method 2017 - 12 - 11 发布 吉林省质量技术监督局 2018 - 04 - 01 实施 发 布 DB22/T 2782—2017 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：柴方红、于钦磊、穆国冬、吴丹、白翠、刘冬冬、孙亮、卢松岩、付瑶。 I DB22/T 2782—2017 犬瘟热病毒检测 荧光定量 RT-PCR 方法 1 范围 本标准规定了犬瘟热病毒荧光定量 RT-PCR 检测方法。 本标准适用于犬瘟热诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PBS: 磷酸盐缓冲液 (Phosphate Buffered Solution) RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription PCR） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） HS Taq DNA：热启动脱氧核糖核酸聚合酶（Hot Start Thermos Aquaticus Deoxyribonucleic Acid） Ct：循环阈值（Cycle Threshold） RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid） dNTPs：脱氧核苷三磷酸（Deoxynucleotide Triphosphates） DEPC：二乙基焦磷酰胺（Diethyl Pyrocarbonate） AMV ： 鸟 类 成 髓 细 胞 白 血 病 病 毒 反 转 录 酶 （ Avian Myeloblastosis Retrovirus Reverse Transcriptase） 4 原理 采取 TaqMan 方法，以犬瘟热病毒 F 基因为靶基因设计一对保守的特异性引物和一条特异性的荧 光双标记探针。探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5'端标记 FAM 荧光素为报告荧光基团（R）， 3'端标记的 TAMRA 荧光素（Q）在近距离内能吸收5'端荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。 反应在退火时，引物和探针同时与目的基因片段结合，探针上 R 基团发出的荧光信号被 Q 基团所吸收， 仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq 酶发挥5'-3'的外切核酸酶功能，将探针降解。 这样探针上的 R 基团游离出来，所发出的荧光不再为 Q 所吸收而被检测仪所接受。随着 PCR 反应的 循环进行，PCR 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 5 试剂和耗材 1 DB22/T 2782—2017 5.1 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 5.1.1 10 mmol/L PBS，制备见附录 A。 5.1.2 病毒 RNA 提取试剂盒。 5.1.3 DEPC 水，去离子水中加入 0.1% DEPC，37 ℃ 作用 1 h，121 ℃±2 ℃，高压灭菌 15 min 。 5.1.4 dNTP，2.5 mmol/L。 5.1.5 HS Taq DNA ，5 U/μL。 5.1.6 AMV 反转录酶，5 U/μL。 5.1.7 RNA 酶抑制剂，40 U/μL。 5.1.8 阴性对照，灭菌双蒸水。 5.1.9 阳性对照，疫苗株 Onderstepoort 株。 5.2 耗材 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7 5.2.8 6 组织匀浆器或研钵。 医用剪刀。 医用镊子。 1.5 mL 灭菌离心管。 15 mL 离心管。 PCR 八联排管。 吸头，10 μL，200 μL，1 000 μL。 医用棉签。 仪器设备 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.1.5 7 分析天平，感量 0.1 mg。 高速冷冻离心机，12 000 r/min 以上。 荧光定量 PCR 扩增仪。 冰箱，2 ℃～8 ℃，-20 ℃ 和 -70 ℃ 三种。 可调移液器，最大量程为 10 μL，200 μL，1 000 μL。 引物 荧光定量 RT-PCR 检测引物序列与浓度见表1。 表1 引物名称 犬瘟热病毒荧光定量 RT-PCR 检测用引物与浓度 引物序列 浓度 μmol/L 上游引物（F） 5'-CACAAATCACTGCAGGGATAGC- 3' 10 下游引物（R） 5'-CAAGGCTAGTTCTCAGAGATTGGAT- 3' 10 探针（P） FAM-TCCAACCTCAATGCTCAA-MGB 10 2 扩增片段长度 78 bp DB22/T 2782—2017 8 操作步骤 8.1 8.1.1 8.1.2 8.2 采样器具前处理 1.5 mL 离心管（5.2.4）和 15 mL 离心管（5.2.5）经 121 ℃± 2 ℃ 高压灭菌 15 min。 医用剪刀（5.2.2）、镊子（5.2.3）、组织样品研磨器（5.2.1）经 160 ℃干热灭菌 2 h。 样品的采集和处理 8.2.1 活犬用拭子（5.2.8）采集眼周分泌物、鼻液、粪便，采集样品的拭子用少量 PBS（5.1.1） 浸 润后，3 000 r/min 离心 15 min，取上清液待检。 8.2.2 病死犬可采集肺、肝、脾等器官组织，每份组织分别从三个不同的位置称取样品约 1 g，用手 术剪剪碎混匀后取 0.05 g 于研磨器中，将待检组织加等体积 PBS（5.1.1） 研磨匀浆，8 000 r/min 离 心 2 min，取上清液待检。 8.3 RNA 的提取 使用病毒 RNA 提取试剂盒（5.1.2）提取犬瘟热病毒 RNA 后，加入 20 μL DEPC 水（5.1.3）和 2 μL RNA酶抑制剂（5.1.7），轻柔混匀，溶解管壁上的 RNA，冰上保存备用。提取的 RNA 应迅速进行荧 光定量 RT-PCR（6.1.3）扩增，或置于 -70 ℃ 冰箱（6.1.4）备用。 8.4 检测 8.4.1 反应体系配制见表 2。 表2 反应体系 体系成分 用量 终浓度 4×PCR Buffer 5.0 μL 1× dNTPs 4.0 µL 0.5 μmol/L HS Taq DNA 1.0 µL 0.25 U/μL 反转录酶 0.4 µL 4.0 U/μL 上、下游引物 FR 1.4 µL 0.7 μmol/L 探针 P 0.5 µL 0.25 μmol/L DEPC水 2.7 µL 模板RNA 5.0 µL 总量 20.0 µL 8.4.2 在荧光定量 PCR 扩增仪上进行以下反应： a) 45 ℃ 15 min ，95 ℃ 1 min ； b) 95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s， 40 个循环。 9 9.1 结果判定 结果分析条件设定 3 DB22/T 2782—2017 试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct 值直接读取检测结果，Ct 值为每个反应管内的荧光 信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最 高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。 9.2 9.2.1 9.2.2 9.2.3 9.3 质控标准 阴性对照无 Ct 值并且无典型扩增曲线。 阳性对照的 Ct 值应＜28.0，并出现特定的扩增曲线。 如阴性对照和阳性条件不满足以上所有条件，此次实验视为无效。 结果描述及判定 9.3.1 阴性，无 Ct 值，无典型的扩增曲线，表示样品中无犬瘟热病毒核酸，样品判为阴性。 9.3.2 阳性，Ct 值 ≤30.0，出现典型的扩增曲线，表示样品中存在犬瘟热病毒核酸，样品判为阳性。 9.3.3 疑似，30.0 ＜ Ct 值＜ 36.0，出现特定的扩增曲线，样品判为疑似。应重新采样检测，仍为 疑似，判定为阳性。 4 DB22/T 2782—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 磷酸缓冲生理盐水 A.1 A液 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液 最后定容至 1 000 mL，混匀。 A.2 B液 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液 最后定容至 1 000 mL，混匀。 A.3 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）71.64 g，先加适量去离子水溶解， 称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）31.21 g，先加适量去离子水溶解， 0.02 mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）的配制 量取 0.2 mol/L 的 A 液 360 mL，0.2 mo1/L 的 B 液140 mL，称取氯化钠 38 g，用无离子水溶 解稀释至 5 000 mL，4 ℃ 保存。 _________________________________ 5