ICS 11.020 C 05 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 396.6—2017 代替 DB 22/T 396-2014 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 6 部分：细菌回复突变试验 Toxicological evaluation procedures and test methods for health care products Part 6: Ames test 2017 - 11 - 10 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 12 - 30 实施 发 布 DB22/T 396.6—2017 前 言 DB22/T 396《保健用品毒理学评价程序与检验方法》拟分为如下部分： ——第 1 部分：评价程序； ——第 2 部分：急性经皮毒性试验； ——第 3 部分：长期经皮毒性试验； ——第 4 部分：皮肤刺激性试验； ——第 5 部分：皮肤变态反应试验； ——第 6 部分：细菌回复突变试验； ——第 7 部分：啮齿动物微核试验； ——第 8 部分：小鼠精子畸形试验； ——第 9 部分：哺乳动物培养细胞染色体畸变试验； ——第 10 部分：致畸试验； ——第 11 部分：致癌试验； ——第 12 部分：人体皮肤斑贴试验。 本部分为DB22/T 396-2017的第6部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本部分代替DB22/T 396-2014《保健用品毒理学评价程序与检验方法》，与DB22/T 396-2014相比， 结构做了较大调整。除编辑性修改外，主要技术变化如下： ——增加了警示 ——增加了范围； ——增加了仪器； ——增加了培养基与试剂； ——修改了试验测试； ——修改了数据处理和评价结果。 本部分由吉林省卫生与计划生育委员会提出并归口。 本部分起草单位：吉林省疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：张晶莹、宋昕恬、孟令仪、吴晓刚、孙兰、隋自洁、高峰。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： ——DB22/T 396-2004； ——DB22/T 396-2014。 I DB22/T 396.6—2017 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 6 部分：细菌回复突变试验 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了保健用品毒理学细菌回复突变试验评价程序。 本标准适用于保健用品毒理学细菌回复突变试验检验方法。 2 鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验（Ames 试验） 2.1 菌株 常用组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌(Samomlla typhimurium)TA98、TA100、TA97和TA102，经检定符 合要求，-80 ℃或液氮冻存备用。 2.2 仪器和设备 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7 2.2.8 2.2.9 2.3 培养箱。 恒温水浴。 压力蒸汽消毒器。 干烤箱。 低温冰箱(-80℃)或液态生物容器、普通冰箱。 天平(精确度 0.1g 或 0.0001g)。 菌落计数仪。 低温高速离心机。 玻璃器皿等。 培养基与试剂 2.3.1 营养肉汤培养基 牛肉膏 5.0g 胰胨（或混合蛋白胨） 5.0g 氯化钠 2.5g 磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 1.3g 蒸馏水 500ml 加热溶解，调节pH至7.4，分装后0.103 MPa20min灭菌，普通冰箱保存备用，保存期不超过半年。 2.3.2 营养肉汤琼脂培养基 1 DB22/T 396.6—2017 用作a.基因型鉴定的结晶紫敏感试验，抗氨苄青霉素和四环素试验，紫外线敏感性试验。b.细菌活 力鉴定。 琼脂粉 1.5g 营养肉汤培养基 100ml 加热融化后调pH至7.4，0.103 MPa20min灭菌。 2.3.3 底层培养基所需试剂及配置方法 2.3.3.1 磷酸盐储备液 磷酸氢钠铵（NaNH4HPO4·4H2O） 柠檬酸（C6H8O7·H2O） 磷酸氢二钾(K2HPO4 ) 硫酸镁 (MgSO4·7H2O) 加蒸馏水至100 ml，0.103MPa20min灭菌。 17.5g 10.0g 50.0g 1.0g 注：待其他试剂完全溶解后再将硫酸镁缓慢放入其中继续溶解，否则易析出沉淀。 2.3.3.2 40%葡萄糖溶液 葡萄糖 加蒸馏水至100 ml，0.055 MPa20min灭菌。 2.3.3.3 40.0g 1.5%琼脂培养基 琼脂粉 蒸馏水 融化后0.103MPa20min灭菌。 2.3.3.4 6.0g 400 ml 底层培养基（无菌操作） 趁热（80˚C），在灭菌琼脂培养基中（400 ml）依次加入： 磷酸盐储备液 8 ml 40%葡萄糖溶液 20 ml 充分混均，待凉至80˚C左右时倒平皿，每皿（ø90mm）25 ml，37 ˚C培养过夜以除去水分及检查有 无污染。 2.3.4 顶层培养基的成分及制备 2.3.4.1 顶层琼脂 琼脂粉 氯化钠 加蒸馏水至 2.3.4.2 0.5mmol/L 组氨酸-生物素溶液（诱变试验用） D-生物素（分子量224） L-组氨酸（分子量155） 加蒸馏水至 2 3.0 g 2.5 g 500 ml 30.5 mg 17.4 mg 250 ml DB22/T 396.6—2017 2.3.4.3 顶层培养基制备：加热融化顶层琼脂，每 100 ml 顶层琼脂中加 10 ml 0.5 mmol/L 组氨酸-生物 素溶液。混匀，分装在 100 ml 三角瓶中，0.103 MPa，20 min 灭菌。用时融化分装小试管，每管 2 ml， 在 45 ˚C 水浴中保温。 2.3.5 特殊试剂和培养基的配制 2.3.5.1 0.8 %氨苄青霉素溶液（鉴定菌株用，无菌配置） 称取氨苄青霉素40 mg，用0.02 mol/L氢氧化钠溶液稀释至5 ml，保存于冰箱。 2.3.5.2 0.1%结晶紫溶液（鉴定菌株用） 称取100 mg结晶紫，溶于100 ml无菌水。 2.3.5.3 L-组氨酸溶液和 0.5 mmol/L D-生物素溶液（鉴定菌株用） 称取L-组氨酸0.4043 g和D-生物素12.2 mg，分别溶于100 ml蒸馏水，0.103 MPa 20 min灭菌，保 存于4 ˚C冰箱。 2.3.5.4 0.8%四环素溶液（用于四环素抗性试验和氨苄青霉素-四环素平版） 称取四环素40 mg，用0.02 mol/L盐酸稀释至5 ml，保存于4˚C冰箱。 2.3.5.5 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素-四环素平板 每1000 ml中由以下成份组成： 底层培养基 910 ml 磷酸盐储备液 20 ml 40%葡萄糖溶液 50 ml 组氨酸水溶液（0.4043g/100 ml） 10 ml 0.5mmol/L D-生物素溶液 6 ml 0.8%氨苄青霉素溶液 3.15 ml 0.8%四环素溶液 0.25 ml 四环素仅在使用对四环素有抗性的TA102时加入。以上成分均已分别灭菌或无菌制备。 2.3.5.6 组氨酸-生物素平板（组氨酸需要试验用） 每1000 ml中由以下成份组成： 底层培养基 磷酸盐储备液 40%葡萄糖溶液 组氨酸水溶液（0.4043 g/100 ml） 0.5 mmol/L D-生物素 以上成分均已分别灭菌。 2.3.5.7 914 ml 20 ml 50 ml 10 ml 6 ml 二甲基亚砜 光谱纯，0.103 MPa 20 min灭菌。 2.3.6 S-9 辅助因子（混合液试剂）的配制 3 DB22/T 396.6—2017 2.3.6.1 0.4mol/L 氯化镁（MgCL2））溶液 氯化镁称取3.8 g ，加蒸馏水稀释至100 ml。 2.3.6.2 1.65mol/L 氯化钾（KCL）溶液 氯化钾称取12.3 g，加蒸馏水稀释至100 ml。 2.3.6.3 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.4） 每500 ml由以下成份组成： 磷酸氢二钠（Na2HPO4）(14.2 g/500 ml) 磷酸二氢钠 (NaH2PO4·H2O) (13.8 g/500 ml) 调pH至7.4，0.103 MPa 20 min灭菌或滤菌。 2.3.6.4 440 ml 60 ml 辅酶-Ⅱ（氧化型）溶液 准确称取辅酶-Ⅱ，用无菌蒸馏水溶解配制成0.025mol/L溶液，低温保存（-20˚C以下）。 2.3.6.5 葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液 称取葡萄糖-6-磷酸钠盐，用无菌蒸馏水溶解配制成0.05mol/L溶液，低温保存（-20˚C以下）。 2.3.6.6 10%S-9 混合液的配制 每10 ml由以下成份组成，临用时配置： 磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.4） 氯化钾溶液（1.65 mol/L ） 氯化镁溶液（0.4 mol/L ） 葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液（0.05 mol/L） 辅酶-Ⅱ溶液（0.025 mol/L） 肝S-9液 混均，至冰浴中待用。 2.4 6.0 0.2 0.2 1.0 1.6 1.0 ml ml ml ml ml ml 剂量 至少应采用五种不同剂量。决定受试物最高剂量的限制因素，是对细菌的毒性和溶解度。最高剂量 一般采用5 mg/皿，最低剂量一般为1 μg/皿或0.1 μg/皿。但如果受试物达某一浓度时，对细菌生长有 抑制作用，则该剂量不宜作本试验，应弃去不用。 2.5 代谢活化 应用诱导剂混合物处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9），进行体外代谢活化试验，即在加S9和不 加S9平行条件下测试。 2.6 对照 阴性、阳性对照和S9对照。原则上阴性对照为溶剂对照；阳性对照为已知阳性致突变剂，如敌克松 （Dexon）对照。 2.7 4 试验测试 DB22/T 396.6—2017 实验时，将含 0.5 mmol/L 组氨酸-0.5 mmol/L 生物素溶液的顶层琼脂培养基 2.0 ml 分装于试管 中，45 ℃水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增菌液 0.1 ml，受试物溶液 0.1 ml和 S9 混合液 0.5 ml（需代谢活化时），充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。水平放置待冷 凝固化后，倒置于 37 ℃培养箱里孵育 48 h。记数每皿回变菌落数，每一浓度至少三皿，求出平均值。 实验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、阳性诱变剂对照和无菌对照。 3 数据处理和结果判断 记录受