ICS 11.020 C 04 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 394.4—2017 代替 DB 22/T 394-2004 保健用品微生物检验方法 第 4 部分：金黄色葡萄球菌测定 Microbiological examine method for health care material Part 4:Determination of Staphylococcus aureus 2017 - 11 - 10 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 12 - 30 实施 发 布 DB22/T 394.4—2017 前 言 DB22/T 394《保健用品微生物检测方法》拟分为如下部分： ——第1部分：菌落总数测定； ——第2部分：耐热大肠菌群测定； ——第3部分：铜绿假单胞菌测定； ——第4部分：金黄色葡萄球菌测定； ——第5部分：霉菌和酵母菌数测定； 本部分为DB22/T 394-2017的第4部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本部分代替DB22/T 394-2004《保健用品微生物检验方法》，与DB22/T 394-2004相比，结构做了较 大调整。除编辑性修改外，主要技术内容变化如下： ——删除了乙型溶血性链球菌； ——删除了定量杀菌试验。 本部分由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。 本部分起草单位：吉林省疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：刘桂华、黄鑫、张立夫、赵薇、杨修军。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： ——DB22/T 394-2004。 I DB22/T 394.4—2017 保健用品微生物检验方法 第 4 部分：金黄色葡萄球菌测定 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了保健用品微生物中金黄色葡萄球菌的测定方法。 本标准适用生产和经营的保健用品中金黄色葡萄球菌的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 金黄色葡萄球菌 staphylococcus aureus 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶 阳性。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯 。实验用水符合GB/T 6682中二级水的要求。 4.1 灭菌生理盐水:详见附录 A.1。 4.2 灭菌液体石蜡:详见附录 A.2。 4.3 灭菌吐温-80:详见附录 A.3。 4.4 SCDLP:详见附录 A.4。 4.5 7.5 % 的氯化钠肉汤:详见附录 A.5。 4.6 Baird Parker 平板:详见附录 A.6。 4.7 血琼脂培养基:详见附录 A.7。 4.8 革兰氏染液:详见附录 A.8。 4.9 甘露醇发酵培养基:详见附录 A.9。 4.10 兔（人）血浆:详见附录 A.10。 1 DB22/T 394.4—2017 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 6 天平:感量 0.1 g。 灭菌刻度吸管:10 mL、5 mL、1 mL。 高压灭菌器。 量筒:100 mL、200 mL、2000 mL。 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:44.5 ℃±0.5 ℃。 无菌锥形瓶: 100 mL、200 mL、250 mL、2000 mL。 研钵。 振荡器。 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃、42 ℃±1 ℃、28 ℃±2 ℃。 接种针、接种环。 显微镜。 灭菌试管:18 mm×150 mm。 样品 6.1 样品的采集 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批保健用品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检 验时，应从不少于2个包装单位的取样中共取10 g(5.1)或10 mL(5.2)。包装量小于20 g的样品，采样时 可适量增加样品包装数量。 6.2 注意事项 6.2.1 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被 污染。 6.2.2 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应 放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。 6.2.3 若只有一个样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做微生 物检验，再将剩余样品做其它分析。 6.2.4 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿 及材料均应事先灭菌(5.3)，全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。 6.2.5 如检出金黄色葡萄球菌，自报告发出之日起该菌种应保存一个月。 6.3 样品的制备 6.3.1 液体样品 水溶性液体样品，用灭菌吸管吸取10 mL (5.4)加到90 mL (5.4)灭菌生理盐水中，混匀后，制成1:10 匀液。 6.3.2 油性液体样品 取样品10 g（5.1），先加5 mL（5.2）灭菌液体石蜡混匀，再加10 mL（5.2）灭菌的吐温-80，在 40 ℃～44 ℃水浴(5.5)中振荡混合10 min，加入灭菌的生理盐水75 mL（5.4）（在40 ℃～44 ℃ 水浴 中预温），在40 ℃～44 ℃水浴（5.5）中乳化，制成1:10的悬液。 2 DB22/T 394.4—2017 6.3.3 膏、霜、乳剂半固体状样品 亲水性的样品，称取10 g（5.1），加到装有玻璃珠及90 mL 灭菌生理盐水的三角烧瓶(5.6)中，充 分振荡混匀，静置15 min，用其上清液作为1:10的匀液。 疏水性样品，称取10 g（5.1），放到灭菌的研钵(5.7)中，加10 mL（5.2）灭菌液体石蜡，研磨成 粘稠状再加入10 mL（5.2）灭菌吐温-80，研磨待溶解后，加70 mL（5.4）灭菌生理盐水，在40 ℃～44 ℃水浴（5.5）中充分混合，制成1:10匀液。 6.3.4 固体样品 称取10 g（5.1），加到90 mL（5.4）灭菌生理盐水中，充分振荡(5.8)混匀，使其分散混悬，静置 后，取上清液作为1:10的匀液。 6.3.5 膜状样品 2 取10 cm ，将膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中（5.6），加100 mL（5.4）生理盐水，使成10 mL/cm 浓度，浸泡10 min到15 min，摇匀即得。 6.3.6 2 含抑菌成分检验样品的制备 6.3.6.1 稀释法:用稀释液和培养基将样品稀释到一定浓度，使其抑菌成分的浓度减少到无菌作用的浓 度，再进行检验。 6.3.6.2 中和法:在检验样品或培养基中加入吐温-80 和卵磷脂作为中和剂，以中和其抑菌效果。 6.3.6.3 对吸水膨胀或粘度大的样品，可制成 1:20 样液。 7 试验步骤 7.1 培养 7.1.1 增菌培养 取1:10稀释的样品10 mL（5.2）接种到90 mL（5.4）SCDLP液体培养基中，置36 ℃±1 ℃培养箱（5.9）， 培养24 h±2 h。 注：如无此培养基也可用7.5%氯化钠肉汤。 7.1.2 分离培养 取阳性对照菌株，同时自上述增菌培养液中，取1～2接种环（5.10），划线接种在 Baird Parker 平板培养基，如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板，置36 ℃±1 ℃ 培养（5.9）48 h。在血琼脂 平板上菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在 Baird Parker培养基 上为圆形,光滑，凸起，湿润，直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色。周围为一混浊带， 在其外层有一透明带。用接种针（5.10）接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似 菌落，但无混浊带及透明带。挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置36 ℃±1 ℃培养（5.9）24 h±2 h。 7.2 染色镜检 挑取分纯菌落，涂片,进行革兰氏染色，镜检（5.11）。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列成 葡萄状，无芽胞，无夹膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为0.5 μm～1 μm。 7.3 生化试验 3 DB22/T 394.4—2017 7.3.1 甘露醇发酵试验 取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，在培养基液面上加入2 mm～3 mm（5.2）的灭菌液体 石蜡，置36 ℃±1 ℃ 培养（5.9）24 h±2 h，金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。 7.3.2 血浆凝固酶试验 吸取1:4新鲜血浆0.5 mL（5.2），置于灭菌小试管（5.12）中，加入待检菌24 h±2 h 肉汤培养物 0.5 mL（5.2）。混匀，放36 ℃±1 ℃恒温箱（5.9）或恒温水浴（5.5）中，每半小时观察一次，6 h 之 内如呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5 mL （5.2），分别加入灭菌1:4血浆0.5 mL（5.2），混匀，作为对照。 8 试验数据处理 凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇 产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。 9 防止污染措施 应按照GB 19489的规定执行。 4 DB22/T 394.4—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂或材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 A.1 生理盐水: A.1.1 成分 氯化钠 蒸馏水 A.1.2 8.5 g 1000 mL 制法 溶解后，分装10 mL 管后，121 ℃高压灭菌20 min。 A.2 灭菌液体石蜡 取液体石蜡50 mL，121 ℃高压灭菌20 min。 A.3 灭菌吐温-80 取吐温-80 50 mL，121 ℃高压灭菌20 min。 A.4 SCDLP液体培养基 A.4.1 成分 酪蛋白胨 大豆蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钾 葡萄糖 卵磷脂 吐温-80 蒸馏水 A.4.2 17 g 3 g 5 g 2.5 g 2.5 g 1 g 7 g 1000 mL 制法 先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调节pH为7.2～7.3分装， 121 ℃高压灭菌20 mi