ICS 11.020 C 04 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 396.2—2017 代替 DB22/T 396-2014 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 2 部分：急性经皮毒性试验 Toxicological evaluation procedures and test methods for health care products Part 2: Acute dermal toxicity test 2017 - 11 - 10 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 12 - 30 实施 发 布 1 DB22/T 396.2—2017 前 言 DB22/T 396《保健用品毒理学评价程序与检验方法》拟分为如下部分： ——第 1 部分：评价程序； ——第 2 部分：急性经皮毒性试验； ——第 3 部分：长期经皮毒性试验； ——第 4 部分：皮肤刺激性试验； ——第 5 部分：皮肤变态反应试验； ——第 6 部分：细菌回复突变试验； ——第 7 部分：啮齿动物微核试验； ——第 8 部分：小鼠精子畸形试验； ——第 9 部分：哺乳动物培养细胞染色体畸变试验； ——第 10 部分：致畸试验； ——第 11 部分：致癌试验； ——第 12 部分：人体皮肤斑贴试验。 本部分为DB22/T 396-2017的第2部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本部分代替DB22/T 396-2014《保健用品毒理学评价程序与检验方法》，与DB22/T 396-2014相比， 结构做了较大调整。除编辑性修改外，主要技术变化如下： ——增加了警示； ——增加了范围； ——增加了仪器； ——增加了附录 A、附录 B 本部分为 DB22/T 396-2017《保健用品毒理学评价程序与检验方法》的第 2 部分。 本部分由吉林省卫生与计划生育委员会提出并归口。 本部分起草单位：吉林省疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：孟令仪、宋昕恬、张晶莹、孙兰、吴晓刚、孙兰、隋自洁、高峰。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： ——DB22/T 396-2004； ——DB22/T 396-2014。 DB22/T 396.2—2017 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 2 部分：急性经皮毒性试验 检验方法 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了保健用品毒理学急性经皮毒性试验评价程序。 本标准适用于保健用品毒理学急性经皮毒性试验检验方法。 2 保健用品毒理学急性经皮毒性试验检验方法 2.1 材料 2.1.1 动物 首选白色家兔，也可用白色豚鼠、大鼠。家兔体重2 kg左右；豚鼠300 g左右；大鼠200 g～300 g。 受试动物应皮肤光滑，无损伤，无皮肤病。 2.1.2 受试物 如为膏剂或液体剂型，可直接涂抹于去毛皮肤上。若受试物是固体粉末或散剂，则需加适量水或适 当的赋形剂(如羊毛脂、凡士林、橄榄油等〉混匀，以保证受试物与皮肤良好接触。 2.1.3 仪器 2.1.3.1 2.1.3.2 2.2 电子天平：精确到 0.1g； 大体显微镜。 试验方法 2.2.1 皮肤准备 在试验前24 h，将动物背部脊柱两侧去毛（采用剪、剃或适宜的脱毛剂），去毛范围约为体表面积 2 2 10 %左右，方法见附录A，家兔约150 cm ，豚鼠和大鼠约40 cm 。 2.2.2 受试物给予方法 受试物涂抹后以适当的方法固定，如用无刺激性纱布、胶布或有孔尼龙绷带固定。大鼠或豚鼠也可 用适当大小的橡皮套(剪去手指的橡皮手套)，把整个背部和腹部包住。如受试物是液体，则应在其上复 以聚乙烯薄膜，然后再包扎固定，以防止液体挥发。试验过程中，要注意防止动物舔食受试物。 2.2.3 剂量和分组 DB22/T 396.2—2017 一般分3个剂量组，其中一个为赋形剂对照组，两个给受试物组，高剂量组剂量为低剂量的2 倍～4 倍。为了提高给受试物剂量可提高浓度或增加24 h内给受试物次数。大鼠或豚鼠每组8 只-10 只，家兔 每组4 只，雌雄各半。如果受试物毒性较低，可采用一次限量法，即用10只动物（雌雄各半）皮肤涂抹 2000 mg/kg体重剂量，当未引起动物死亡，可考虑不再进行多个剂量的急性经皮毒性试验。 2.3 观察指标 实验动物分笼饲养。给予受试物后24 h，如未中毒死亡，可用温水或其他无刺激性溶剂除去残留于 皮肤的受试物或赋形剂。继续观察每天一下，连续7 d，逐日记录动物的一般状态、中毒表现和死亡情 况见表1。如外观行为、异常运动、精神状态、食欲、大便、肤色、呼吸、异常分泌物等。如有动物死 亡，应立即进行尸检和肉眼观察，当有肉眼可见病变时，则应进行病理组织学检查。 表1 动物的毒性反应 器官系统 检查项目 毒性表现 中枢和运动 行为 行为变化、不正常叫声、躁动不安或静伏少动 异常运动 抽搐、震颤、共济失调、麻痹、局部肌肉抽动、强迫运动 对刺激的反应 烦躁易怒、冷漠、感觉过敏、抑制状态 神经反射 迟钝、丧失 神经系统 （含翻正反射） 植物神经系统 呼吸系统 心血管系统 胃肠系统 泌尿生殖系统 皮肤和皮毛 眼 其他 2.4 瞳孔 缩小、扩大 分泌物 流涎、流泪 鼻 分泌物 呼吸及其频率 急促、过急、过慢、阵式呼吸、Kussmaul 氏呼吸 心前区触诊 心室颤动、心动过缓、心律不齐、心搏过强或微弱 大便 腹泻、便秘 腹部形态 胀气、收缩 大便硬度、颜色 不成形、黑便或土色便 阴唇、乳腺 肿胀 会阴部 肮脏 颜色、完整性 充血、紫绀、苍白、竖毛、皮下松驰、发疹 眼睑 下垂 眼球 凸出、震颤、透明度降低 注射部位 肿胀 一般状态 异常姿态、消瘦等 结果评价 评价试验结果时，应将经皮LD50与观察到的毒性效应和尸检所见相结合考虑，LD50值是受试物毒性分 级和标签标识以及判定受试物经皮肤吸收后引起动物死亡可能性大小的依据,LD50计算方法见附录B。引 用LD50值时一定要注明实验动物的种属、性别、染毒途径、观察期限等，评价应包括动物接触受试物与 动物异常表现(包括行为和临床改变、大体损伤、体重变化、致死效应与其它毒性作用)的发生率和严重 程度之间的关系。毒性分级见表2。 表2 2 皮肤毒性分级 DB22/T 396.2—2017 级 别 LD50(mg/kg) 极毒 LD50< 5 剧毒 5 ﹤LD50﹤ 44 中等毒 44 ﹤LD50﹤ 350 低毒 350 ﹤LD50﹤ 2180 微毒 LD50≥ 2180 DB22/T 396.2—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 实验动物体表面积估算方法 A.1 兔 2 s = k × m 3 ..................................... (A.1) 式中： s ——体表面积，cm2； k ——常数，一般成年家兔为10； m ——动物体重，g。 例：体重 2 kg 成年家兔体表面积： s = 10 × 2000 2 3 2 lg S = lg 10 + lg 2000 3 = 1 + 0.667 × 3.3010 = 1 + 2.2008 = 3.2008 查反对数表：S = 1588cm 2 A.2 豚鼠 2 s = k × m 3 ..................................... (A.2) 式中： s ——体表面积，cm2； k ——常数， k = 9.26 ； m ——动物体重，g。 例:体重 438 g 豚鼠的体表面积： 2 lg S = lg 9.26 + lg 438 3 2 = 0.9666 + × 0.8805 3 = 0.9666 + 1.7610 = 2.7276 查反对数表：S = 534cm 2 4 DB22/T 396.2—2017 A.3 大鼠、小鼠 2 s = k × m 3 ..................................... (A.3) 式中： s ——体表面积，cm2； k ——常数， k = 0.0913 ； m ——动物体重，g。 例：体重 200g 大鼠的体表面积： s = 0.0913 × (0.2) 3 2 2 lg S = lg 0.0913 + lg 0.2 3 2 = 2.9605 + × 1.3010 3 = 2.9605 + 1.5340 = 2.1945 查反对数表：S = 3.123cm 2 DB22/T 396.2—2017 BB 附 录 B （规范性附录） LD50 计算方法 B.1 霍恩氏法（Horn） 一般各剂量组使用5只动物，常用的剂量系列有两排： 1.01 ⎫ 2.15⎪⎪ t ⎬ × 10 4.64⎪ 10.0 ⎪⎭ 1.0 ⎫ 3.16⎪⎪ t ⎬ × 10 10.0 ⎪ 31.6⎪⎭ t = 0,±1,±2,±3L 前排系列的剂量间距较后排系列为小，结果较为精确，所以一般常选用之。 预备试验：通常采用10 mg/kg，100 mg/kg和1000 mg/kg的剂量，各剂量使用2只～3只动物。根据 24 h内动物死亡情况，估计LD50的可能范围，以确定正式试验所用的剂量。 正式试验:按预试所确定大概的致死剂量范围选用一组适宜的剂量系列，根据四个剂量组的动物死 亡数，从Horn氏法LD50计算用表中，可求出LD50值及其可信限。 此法的优点是简单易行，使用动物少，可用来初步了解受试物的毒性强弱。缺点是所得LD50的可信 限范围较宽，不够精确。 B.2 机率单位——对数图解法 先把剂量的对数值和相应反应的机率单位用点代表画在图上（用机率对数图纸直接把剂量和死亡百 分数画在图上）。画线时应照顾所有图上各点，使点散布在线的上下，并使线上点的距离和线下点的距 离能相互抵消，特别注意在死亡率15%到85%间的点，机率单位4与6之间的点，尽量使线接近这部分的点。 当直线划定后，由图直线上50%死亡率(机率单位为5)的相应剂量对数值，就是半数致死量（LD50）的对 数值，经反对数变换后即得LD50的剂量。 半数致死量（LD50）可信限估计： 先求 LD50 的标准差S按式（B.1）： s= x 2 − x1 ..................................... (B.1) y 2 − y1 式中：