ICS 11.220 B 41 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1621—2016 水禽 1 型甲肝病毒亚型感染诊断技术 Diagnostic Protocol for subtype of duck hepatitis A virus type -1 infection in waterfowl 2016 - 12 - 30 发布 福建省质量技术监督局 2017 - 04 - 01 实施 发 布 DB35/T 1621—2016 目 次 前言 .................................................................................................................................................................... II 1 范围 .............................................................................................................................................................. 1 2 疫病概述 ...................................................................................................................................................... 1 3 临床诊断 ...................................................................................................................................................... 1 4 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）诊断 ............................................................................................... 2 附录 A（规范性附录） 相关试剂的配制 .................................................................................................... 4 附录 B（资料性附录） RT-PCR 检测结果电泳图例 .................................................................................. 6 附录 C（资料性附录） 水禽 1 型甲肝病毒亚型 VP1 基因序列 ................................................................ 7 I DB35/T 1621—2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：黄瑜、傅光华、傅秋玲、白泉阳、施少华、程龙飞、万春和、陈红梅、陈珍、 朱春华、陈翠腾、刘荣昌、潘飞龙。 II DB35/T 1621—2016 水禽 1 型甲肝病毒亚型感染诊断技术 1 范围 本标准规定了水禽1型甲肝病毒亚型感染的临床诊断要点及病毒核酸检测的反转录-聚合酶链式反 应（RT-PCR）的操作技术规程。 本标准适用于水禽1型甲肝病毒亚型感染的临床诊断和实验室诊断。 2 疫病概述 水禽1型甲肝病毒亚型感染，俗称水禽胰腺炎，是由不同于致雏鸭典型肝炎（肝脏肿大、出血）的 鸭1型甲肝病毒（DHAV-1）的鸭1型甲肝病毒亚型（DHAV-1a）引起雏鸭（鹅）胰腺发黄、出血为特征 的新发疫病。 该病最早于2011年9月发生于我国福建、浙江两省的雏番鸭群，一年四季均有发生，其发病率和病 死率分别为30%～43%、60%～78%不等。其全基因组序列与经典的肝炎型DHAV-1参考毒株核苷酸序 列和氨基酸同源性分别介于93.5%～99.6%和97.9%～99.6%之间，与经典的肝炎型DHAV-1间的抗原亲 缘值（R）为0.62（介于0.32～0.70间）；其特征性剖检病变为胰腺发黄、出血，完全不同于引起典型肝 炎的DHAV-1所致的肝脏肿大、出血特征病变，且在易感动物上也存在明显差异，雏番鸭、雏半番鸭和 雏鹅对该病较易感、北京樱桃谷雏鸭和雏麻鸭对该病不易感，而经典的肝炎型DHAV-1却反之。 3 临床诊断 3.1 临床症状 当雏鸭（鹅）出现以下部分或全部临床症状时，可作为初步诊断的依据： a) 采食或（和）饮水量下降； b) 表现沉郁或扎堆； c) 出现死亡。 3.2 剖检病变 当雏鸭（鹅）出现以下肉眼剖检病变时，可作为初步诊断的依据： 病死雏鸭（鹅）胰腺发黄或（和）存在散在出血点或（和）出血灶。 3.3 初步诊断 当雏鸭（鹅）出现3.1描述的部分或全部临床症状或（和）3.2描述的剖检病变时，可作出初步诊断； 确切诊断需通过实验室做进一步检测。 1 DB35/T 1621—2016 4 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）诊断 4.1 样品采集与处理 尽量采集发病、濒死或病死雏鸭（鹅）的胰腺组织样品，尽快处理，即将采集的组织样品剪碎，与 磷酸盐缓冲液（PBS，配制方法见附录A.1）按照体积比1:3的比例制成组织匀浆液，反复冻融3次， 8 000 r/min离心30 min，取上清，用于RNA抽提，或置-20 ℃冻存备用。若在6 h以上处理的样品，应先 置-20 ℃条件下保存备用，需托运时应确保冷藏或冰冻状态运输。 4.2 仪器设备 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 4.2.7 PCR 仪。 高速台式冷冻离心机。 微量移液器。 组织匀浆器。 电泳仪。 电泳槽。 紫外凝胶成像系统。 4.3 试剂 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 4.3.7 4.3.8 4.3.9 4.3.10 RNA 提取试剂 Trizol。 三氯甲烷。 异丙醇。 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水：配制方法见附录 A.2。 75%乙醇：配制方法见附录 A.3。 溴化乙锭溶液：配制方法见附录 A.4。 1×TAE 缓冲液：配制方法见附录 A.5。 1.0%琼脂糖凝胶：配制方法见附录 A.6。 DNA 相对分子质量标准物：DL2000。 10×加样缓冲液：配制方法见附录 A.7。 4.4 引物 根 据 水 禽 （ 鸭 、 鹅 ） DHAV-1a VP1 基 因 保 守 区 特 征 设 计 特 异 性 引 物 ， 上 游 引 物 F ： 5′GGTGATTCCAACCAGTTAGGGGAT -3′和下游引物R：5′- TTCAATTTCCAGGTTGAGTTCA -3′，用于 扩增目的条带约700 bp大小的VP1基因片段。上、下游引物的使用浓度均为 20 pmol/µL。 4.5 病毒 RNA 提取 病毒RNA提取方法如下： a) 取 250 μL 组织匀浆上清液加入 1.5 mL 灭菌离心管后，加入 750 μL RNA 提取试剂 Trizol，充 分混匀 15 s，再加入 200 μL 预冷的三氯甲烷后，充分倒置混匀，室温静置 10 min。 b) 4 ℃条件下，12 000 r/min 离心 15 min。取经 DEPC 处理水处理的 1.5 mL 灭菌离心管，小心吸 取离心上清液 600 μL，加入等体积-20 ℃预冷的异丙醇，反复颠倒混匀。 c) 4 ℃条件下，12 000 r/min 离心 15 min。轻轻倾倒上清液，加入 800 μL 75%乙醇清洗 2 次，倒 置于吸水纸上 5 min，室温晾干。 2 DB35/T 1621—2016 d) 加入 20 μL DEPC 处理水，轻轻混匀溶解离心管壁上核酸 RNA，2 000 r/min 离心 30 s，提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增或保存于-20 ℃冰箱备用。 也可采用市售商品化的等效核酸RNA提取试剂盒，完成核酸RNA提取。 4.6 对照 以灭活的水禽（鸭、鹅）1型甲肝病毒亚型作为阳性对照，以灭活的禽1型副黏病毒基因组或其他 RNA样品作为阴性对照，以无DNase和RNase的灭菌水作为空白对照。 4.7 RT-PCR 反应 RT-PCR反应体系为25 μL，每个反应管的反应液配置为：依次加入15 μL DEPC处理水，2.5 μL反转 录酶缓冲液，2.5 μL Taq聚合酶缓冲液，0.5 μL dNTP（2.5 mM/L each），0.5ul AMV 反转录酶（5 U/uL）， 0.5 μL Taq DNA 聚合酶（1 U/uL），0.5 μL RNA酶抑制剂（20 U/uL），2条引物各0.5 μL，对应样品的 RNA 3 μL。2 000 r/min离心15 s，使反应混合液都沉降到PCR管底。将上述混合物按照以下步骤进行一 步法RT-PCR：第一步42 ℃，30 min；第二步是PCR循环，95 ℃预热3 min，循环参数为：94 ℃、1 min， 56 ℃、1 min，72 ℃、1 min，循环30次；第三步72 ℃延伸8 min结束。 也可采用市售商品化的等效RT-PCR检测试剂盒，并按照剂盒推荐的条件进行。 4.8 RT-PCR 产物电泳 反应结束后，各检测样品、阴性对照样品、阳性对照样品和空白对照样品均分别取5 μL RT-PCR产 物与0.5 μL加样缓冲液混合，然后加入到1.0%琼脂糖凝胶板的加样孔中，同时加上DNA分子量标准5 μL； 以5 V/cm的电压进行电泳，30 min后在紫外凝胶成像系统观察结果。 4.9 结果判定 当阳性对照样品出现700 bp左右特异性条带（见附录B电泳图2号泳道），阴性对照样品和空白对照 样品均无特异性扩增条带（见附录B电泳图5号、6号泳道），本次实验结果成立有效；当待检样品出现 700 bp左右特异性条带（见附录B电泳图3号泳道）判为阳性样品，无特异性扩增条带（见附录B电泳图 4号泳道）判为阴性样品。 必要时，