书 书 书犐犆犛 ６７ ． ０４０ 犡 ０４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２３４９６ — ２００９ 食品中禁用物质的检测 　 碱性橙染料 高效液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犳狅狉犫犻犱犱犲狀犿犪狋犲狉犻犪犾狊犻狀犳狅狅犱狊 — 犇狔犲狊狅犳犫犪狊犻犮狅狉犪狀犵犲 — 犎犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔犿犲狋犺狅犱 ２００９  ０４  ２７ 发布 ２００９  ０８  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由中国标准化研究院提出并归口 。 本标准起草单位 ： 湖北省产品质量监督检验研究院 （ 国家饮料及粮油制品质量监督检验中心 ）。 本标准主要起草人 ： 文红 、 朱宽正 、 张莉 、 王红 、 吕晓华 、 陈有武 、 范志勇 、 李涛 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２３４９６ — ２００９ 食品中禁用物质的检测 　 碱性橙染料 高效液相色谱法 １ 　 范围 本标准规定了食品中禁用物质 ——— 碱性橙染料的检测方法 。 本标准适用于食品中禁用物质 ——— 碱性橙染料的高效液相色谱法检测 。 本标准中碱性橙 ２ 、 碱性橙 ２１ 、 碱性橙 ２２ 的检出限为 ０．０１ｍｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和实验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — ２００８ ， ＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ， ＭＯＤ ） ３ 　 原理 样品经无水乙醇提取 、 浓缩 、 定容液定容后 ， 用反相色谱柱分离 、 紫外检测器进行色谱分析测定 。 ４ 　 试剂和溶液 除另有规定外 ， 所有试剂均为分析纯 ， 实验用水符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级水要求 。 ４ ． １ 　 无水乙酸铵 ， 优级纯 。 ４ ． ２ 　 无水硫酸钠 。 ４ ． ３ 　 正己烷 。 ４ ． ４ 　 无水乙醇 。 ４ ． ５ 　 甲醇 ， 色谱纯 。 ４ ． ６ 　 乙腈 ， 色谱纯 。 ４ ． ７ 　 ２０ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙酸铵溶液 ： 称取 １．５４ｇ 乙酸铵溶于 １０００ｍＬ 水中 。 ４ ． ８ 　 定容液 ： 取 ６５ｍＬ 甲醇加入 ３５ｍＬ２０ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙酸铵溶液中 ， 混匀 。 ４ ． ９ 　 标准品 ： 碱性橙 ２ 、 碱性橙 ２１ 、 碱性橙 ２２ ， 纯度 ≥ ９５％ 。 ４ ． １０ 　 １．０ｍｇ ／ ｍＬ 碱性橙染料标准储备溶液 ： 分别称取 １００ｍｇ （ 精确至 ０．１ｍｇ ） 碱性橙 ２ 、 碱性橙 ２１ 、 碱性橙 ２２ ， 置于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 加无水甲醇溶解并定容至刻度 ， 混匀 ， 该溶液在 ４℃ 条件下避光保 存 ， 有效期为 １ 个月 。 ４ ． １１ 　 碱性橙染料标准工作溶液 （ 使用时配制 ） ４ ． １１ ． １ 　 ０．１ｍｇ ／ ｍＬ 碱性橙染料标准溶液 Ａ ： 准确移取 １０ｍＬ 碱性橙染料标准储备溶液 （ ４．１０ ） 于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用定容液定容至刻度 ， 混匀 。 ４ ． １１ ． ２ 　 分别移取碱性橙染料标准溶液 Ａ （ ４．１１．１ ） １．００ｍＬ 、 ２．００ｍＬ 、 ５．００ｍＬ 、 １０．００ｍＬ 、 ２０．００ｍＬ 于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用定容液定容至刻度 ， 混匀 。 分别相当于 １．００ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ２．００ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ５．００ μ ｇ ／ ｍＬ 、 １０．００ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ２０．００ μ ｇ ／ ｍＬ 浓度标准溶液 。 ５ 　 仪器与设备 ５ ． １ 　 高效液相色谱仪 ， 附有紫外检测器 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２３４９６ — ２００９ ５ ． ２ 　 天平 ： 感量 ０．０００１ｇ 和 ０．０１ｇ 。 ５ ． ３ 　 超声波清洗仪 。 ５ ． ４ 　 旋转蒸发仪 。 ５ ． ５ 　 离心机 ： ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ５ ． ６ 　 氮吹仪 。 ５ ． ７ 　 旋涡振荡器 。 ５ ． ８ 　 电热板 。 ６ 　 分析步骤 ６ ． １ 　 样品处理 ６ ． １ ． １ 　 固体样品 （ 如辣椒粉 、 豆制品等 ） 将样品粉碎混匀 ， 称取 ２０ｇ （ 准确至 ０．０１ｇ ） 样品 ， 置于 ５０ｍＬ 离心管中 ， 加 ５ｇ 无水硫酸钠 ， ２５ｍＬ 无水乙醇超声提取 ３０ｍｉｎ ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ ， 离心 １０ｍｉｎ ， 将上层提取清液倾出置于离心管中 ， 再次加入 １０ｍＬ 无水乙醇 ， 重复提取 ３ 次 ， 合并提取液 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ ， 离心 １０ｍｉｎ ， 将上层提取清液倾倒于圆底烧 瓶中 ， 于 ４０℃ 减压浓缩至近干 ， 用无水乙醇溶解并转移到刻度试管中 ， 在 ５０℃ 条件下氮气吹干 ， 用定容 液溶解并定容至 ２ｍＬ ； 经 ０．４５ μ ｍ 滤膜过滤后待进样 。 ６ ． １ ． ２ 　 液体样品 将样品混匀 ， 称取 ２０ｇ （ 准确至 ０．０１ｇ ） 样品 ， 置于 １００ｍＬ 烧杯中 ， 电热板上加热挥发至近干 ， 用无 水乙醇溶解并转移到刻度试管中 ， 在 ５０℃ 条件下氮气吹干 ， 用定容液溶解并定容至 ２ｍＬ ； 经 ０．４５ μ ｍ 滤膜过滤后待进样 。 ６ ． １ ． ３ 　 含油样品 将样品混匀 ， 称取 ２０ｇ （ 准确至 ０．０１ｇ ） 样品 ， 置于 ５０ｍＬ 离心管中 ， 加 ５ｇ 无水硫酸钠 ， ２５ｍＬ 无水 乙醇超声提取 ３０ｍｉｎ ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ ， 离心 １０ｍｉｎ ， 将上层提取清液倾出置于离心管中 ， 再次加入 １０ｍＬ 无水乙醇 ， 重复提取 ３ 次 ， 合并提取液 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ ， 离心 １０ｍｉｎ ， 将上层提取清液倾倒于圆底烧瓶中 ， 于 ４０℃ 减压浓缩至近干 ， 用 １５ｍＬ 乙腈溶解并转移到 ２５ｍＬ 刻度试管中 ， 加入 ２ｍＬ 正己烷 ， 涡旋振荡 萃取 ， 弃去正己烷层 ， 重复 ３ 次 ， 将乙腈层倒入圆底烧瓶中 ， 于 ５０℃ 减压浓缩至近干 ， 用无水乙醇溶解并 转移到刻度试管中 ， 在 ５０℃ 条件下氮气吹干 ， 用定容液溶解并定容至 ２ｍＬ 。 经 ０．４５ μ ｍ 滤膜过滤后待 进样 。 ６ ． ２ 　 高效液相色谱测定 ６ ． ２ ． １ 　 色谱条件 ａ ） 　 色谱柱 ： Ｃ １８ （ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ ， ５ μ ｍ ）（ 或相当型号色谱柱 ）； ｂ ） 　 流动相 ： 甲醇 ＋２０ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙酸铵 ＝６５＋３５ ； ｃ ） 　 流速 ： １．０ｍＬ ／ ｍｉｎ ； ｄ ） 　 柱温 ： 室温 ； ｅ ） 　 检测波长 ： 碱性橙 ２ ， ４４９ｎｍ ； 碱性橙 ２１ 、 碱性橙 ２２ ， ４８５ｎｍ ； ｆ ） 　 进样量 ： ２０ μ Ｌ 。 ６ ． ２ ． ２ 　 标准曲线绘制 用配制的碱性橙染料标准工作溶液 （ ４．１１．２ ） 绘制以峰面积为纵坐标 、 工作溶液浓度为横坐标的标 准工作曲线 。 ６ ． ２ ． ３ 　 定量分析 待测样液中应在标准曲线线性范围内 ， 超过线性范围则应稀释后在进样分析 。 ７ 　 结果计算 试样中每种碱性橙染料的含量按式 （ １ ） 分别计算 ： ２ 犌犅 ／ 犜 ２３４９６ — ２００９ 犡 ＝ 犮 × 犞 × １０００ 犿 × １０００ …………………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犡 ——— 试样中每种碱性橙染料的含量 ， 单位为毫克每千克 （ ｍｇ ／ ｋｇ ）； 犮 ——— 由标准曲线查出的试样液中每种碱性橙染料的浓度 ， 单位为微克每毫升 （ μ ｇ ／ ｍＬ ）； 犞 ——— 样品最终定容体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犿 ——— 试样的质量 ， 单位为克 （ ｇ ）。 计算结果保留小数点后一位数字 。 ８ 　 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 １０％ 。 犌犅 ／ 犜 ２３４９６ — ２００９ 书书书犌犅／犜２３４９６—２００９ 附　录　犃 （资料性附录） 碱性橙染料标准色谱图 　　１———碱性橙２１； ２———碱性橙２； ３———碱性橙２２。 图犃．１　碱性橙染料标准色谱图（波长：４４９狀犿） 　　１———碱性橙２１； ２———碱性橙２； ３———碱性橙２２。 图犃．２　碱性橙标准色谱图（波长：４８５狀犿 ） ９００２ — ６９４３２犜／犅犌