书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２３７４１ — ２００９ 饲料中 ４ 种巴比妥类药物的测定 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犳狅狌狉犽犻狀犱狊狅犳犫犪狉犫犻狋狌狉犪狋犲狊犻狀犳犲犲犱狊 ２００９  ０５  １２ 发布 ２００９  ０９  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ７６ ） 提出并归口 。 本标准主要起草单位 ： 农业部饲料质量监督检验测试中心 （ 济南 ）。 本标准主要起草人 ： 李俊玲 、 李会荣 、 强莉 、 刘继明 、 门晓冬 、 李宏 、 杨志强 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２３７４１ — ２００９ 饲料中 ４ 种巴比妥类药物的测定 １ 　 范围 本标准规定了饲料中巴比妥 、 苯巴比妥 、 异戊巴比妥和司可巴比妥的高效液相色谱测定方法和液相 色谱  串联质谱测定法 。 本标准适用于配合饲料 、 浓缩饲料和添加剂预混合饲料中 ４ 种巴比妥类药物的测定 。 高效液相色 谱测定方法定量限为 １ｍｇ ／ ｋｇ ， 液相色谱  串联质谱方法定量限为 ０．０５ｍｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — ２００８ ， ＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ， ＭＯＤ ） ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 （ ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ — ２００５ ， ＩＳＯ６４９７ ： ２００２ ， ＩＤＴ ） ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 　 动物饲料 　 试样的制备 （ ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ — ２００６ ， ＩＳＯ６４９８ ： １９９８ ， ＩＤＴ ） ３ 　 方法原理 试样中的 ４ 种巴比妥类药物用三氯甲烷提取 、 过滤 ， 滤液吹干后溶解过固相萃取小柱净化 ， 洗脱液 蒸干后用甲醇水溶解 ， 在高效液相色谱仪上分离 、 测定 ， 或在高效液相色谱  串联质谱仪上测定 ， 外标法 定量 。 ４ 　 试剂和材料 除非另有说明 ， 在分析中仅使用确认为分析纯的试剂 ， 实验室用水符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 一级水的规定 。 ４ ． １ 　 甲醇 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ３ 　 三氯甲烷 。 ４ ． ４ 　 二氯甲烷 。 ４ ． ５ 　 ２％ 甲醇水溶液 ： 取 ２ｍＬ 甲醇与 ９８ｍＬ 水混合 。 ４ ． ６ 　 甲醇水溶液 ： １＋１ 。 ４ ． ７ 　 乙腈水溶液 ： ３０＋７０ 。 ４ ． ８ 　 磷酸盐缓冲液 ： 犮 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ ＋ＮａＨ ２ ＰＯ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ ） ＝０．１ｍｍｏｌ ／ Ｌ ， ｐＨ＝６．０ 。 称取 １４．２ｇ 的无水 磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ ）， 加水定容至 １０００ｍＬ ， 摇匀 ； 另称取 １５．６ｇ 的磷酸二氢钠 （ ＮａＨ ２ ＰＯ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ ）， 加水定容至 １０００ｍＬ ， 摇匀 。 取上述两种溶液按 １２３＋８７７ 的比例混匀即可 。 ４ ． ９ 　 流动相 ： 甲醇 ＋ 水 ＝４５＋５５ 。 ４ ． １０ 　 巴比妥 、 苯巴比妥 、 异戊巴比妥和司可巴比妥标准品 ： 纯度 ≥ ９９．０％ 。 ４ ． １１ 　 标准贮备液 ： 准确称取巴比妥 、 苯巴比妥 、 异戊巴比妥和司可巴比妥标准品各 ２５ｍｇ ， 分别用甲醇 （ ４．１ ） 溶解 ， 定容至 ２５ｍＬ ， 配成浓度为 １ｍｇ ／ ｍＬ 的标准贮备液 。 ２℃ ～ ８℃ 冷藏保存 ， 有效期三个月 。 ４ ． １２ 　 混合标准中间液 ： 准确移取巴比妥 、 苯巴比妥 、 异戊巴比妥和司可巴比妥贮备液 （ ４．１１ ） 各 ５ｍＬ ， 用甲醇 （ ４．１ ） 定容至 ５０ｍＬ ， 该混合溶液中巴比妥 、 苯巴比妥 、 异戊巴比妥和司可巴比妥的浓度均为 １００ μ ｇ ／ ｍＬ 。 ２℃ ～ ８℃ 冷藏保存 ， 有效期一个月 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２３７４１ — ２００９ ４ ． １３ 　 固相萃取小柱 ： 亲水亲脂平衡固相萃取柱 ， ３ｍＬ （ ６０ｍｇ ）。 ４ ． １４ 　 滤膜 ： ０．２２ μ ｍ 。 ４ ． １５ 　 滤纸 ： 快速 ， １２．５ｃｍ 。 ５ 　 仪器和设备 ５ ． １ 　 高效液相色谱仪 ： 配有紫外检测器或二极管阵列检测器 。 ５ ． ２ 　 液相色谱  串联质谱仪 ： 配电喷雾离子源 。 ５ ． ３ 　 天平 ： 感量为 ０．０００１ｇ 。 ５ ． ４ 　 氮吹仪 。 ５ ． ５ 　 涡旋振荡器 。 ５ ． ６ 　 固相萃取仪 。 ６ 　 试样制备 按 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 采样 。 选取有代表性饲料样品至少 ５００ｇ ， 按 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 规定 ， 制备通过 ０．４５ｍｍ 实验筛的试样 。 ７ 　 试样处理 ７ ． １ 　 提取 称取试料 ２ｇ （ 精确至 ０．０００１ｇ ） 于 １００ｍＬ 离心管中 ， 准确加入 ２５ｍＬ 三氯甲烷 （ ４．３ ）， 涡旋振荡 ２ｍｉｎ ， 过滤 。 准确移取滤液 １５ｍＬ 于具塞试管中 ， ４０℃ 氮吹至干 ， 加入磷酸盐缓冲液 （ ４．８ ） ３ｍＬ ， 涡旋 溶解 ， 备用 。 ７ ． ２ 　 净化 固相萃取小柱分别用 ５ｍＬ 甲醇 （ ４．１ ）、 ５ｍＬ 水 、 ５ｍＬ 磷酸盐缓冲液 （ ４．８ ） 活化 。 取上述提取液 （ ７．１ ） 过柱 ， 再分别用 ５ｍＬ 磷酸盐缓冲液 （ ４．８ ）、 ５ｍＬ 甲醇水溶液 （ ４．５ ） 淋洗 ， 空气抽干 ３０ｍｉｎ ， 用 １０ｍＬ 二氯甲烷 （ ４．４ ） 洗脱 ， 收集洗脱液 ， ４０℃ 氮吹至干 ， 准确移取 １ｍＬ 甲醇水溶液 （ ４．６ ） 溶解残渣 ， 过 ０．２２ μ ｍ 滤膜后待测 。 ８ 　 液相色谱测定 ８ ． １ 　 液相色谱条件 色谱柱 ： Ｃ ８ 柱长 ２５０ｍｍ ， 内径 ４．６ｍｍ ， 粒径 ５ μ ｍ ， 或其他效果等同的 Ｃ ８ 柱 。 柱温 ： 室温 。 进样量 ： ２０ μ Ｌ 。 流动相 ： 甲醇 ＋ 水 ＝４５＋５５ 。 检测器 ： 紫外检测器或二极管阵列检测器 。 检测波长 ： ２１５ｎｍ 。 流速 ： １．０ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 ８ ． ２ 　 标准曲线的绘制 取混合标准中间液 （ ４．１２ ） 适量逐步稀释 ， 用甲醇 （ ４．１ ） 定容 ， 配制成浓度分别为 ０．５ μ ｇ ／ ｍＬ 、 １．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ５．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 １０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ２０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ５０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 的混合标准工作液 ， 浓度由低到高进 样 ， 根据峰面积和浓度计算回归方程 。 ４ 种巴比妥类药物液相色谱条件下标准样品图谱参见图 Ａ．１ 。 ８ ． ３ 　 定量测定 试料溶液 （ ７．２ ） 上机测定 ， 用单点或多点校准法进行定量 。 多点校准法定量 ， 根据峰面积的响应值 ， 从标准曲线中得到待测样中 ４ 种巴比妥类药物的浓度 （ 犮 犻 １ ）； 单点定量 ， 根据样品峰面积的响应值与标准 ２ 犌犅 ／ 犜 ２３７４１ — ２００９ 溶液峰面积的响应值比值与标准溶液浓度的乘积得到待测样中 ４ 种巴比妥类药物的浓度 （ 犮 犻 １ ）。 ８ ． ４ 　 结果计算 试料中 ４ 种巴比妥类药物的含量 犡 犻 １ ， 以质量分数计 ， 单位为毫克每千克 （ ｍｇ ／ ｋｇ ）， 按式 （ １ ） 计算 ： 犡 犻 １ ＝ 犮 犻 １ × 犞 × 犞 ２ × １０００ 犿 × 犞 １ × １０００ …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犮 犻 １ ——— 试料中某种巴比妥药物色谱峰面积对应的浓度 ， 单位为微克每毫升 （ μ ｇ ／ ｍＬ ）； 犞 ——— 加入提取液的总体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犞 ２ ——— 氮吹至干后溶解残渣用甲醇水溶液的体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犿 ——— 试料的质量 ， 单位为克 （ ｇ ）； 犞 １ ——— 移取滤液的体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）。 计算结果保留三位有效数字 。 ８ ． ５ 　 重复性 在同一实验室 、 由同一操作人员完成的两个平行测定结果 ， 相对偏差不大于 １０％ ， 以两次平行测定 结果的算术平均值为测定结果 。 ９ 　 液相色谱  串联质谱法 （ 仲裁法 ） ９ ． １ 　 液相色谱条件 色谱柱 ： Ｃ １８ 柱长 １００ｍｍ ， 内径 ２．１ｍｍ ， 粒径 １．７ μ ｍ ， 或其他效果等同的 Ｃ １８ 柱 ； 柱温 ： ４０℃ ； 进样量 ： ５ μ Ｌ ； 流动相 ： 乙腈 ＋ 水 ， 梯度洗脱 ， 见表 １ ； 表 １ 　 液相色谱  串联质谱流动相梯度洗脱表 时间 ／ ｍｉｎ 水 ／ ％ 乙腈 ／ ％ ０．０ ７０ ３０ ０．５ ７０ ３０ １．０ ５０ ５０ ４．０ ２０ ８０ ４．０１ ７０ ３０ １０．０ ７０ ３０ 　　 流速