书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２３８７３ — ２００９ 饲料中马杜霉素铵的测定 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犪犱狌狉犪犿犻犮犻狀犪犿犿狅狀犻狌犿犻狀犳犲犲犱狊 ２００９  ０５  ２６ 发布 ２００９  １０  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ７６ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 农业部饲料质量监督检验测试中心 （ 济南 ）。 本标准主要起草人 ： 梁萌 、 汤文利 、 任爱丽 、 赵金毅 、 黄莹 、 李永山 、 刘学江 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２３８７３ — ２００９ 饲料中马杜霉素铵的测定 １ 　 范围 本标准规定了测定饲料中马杜霉素铵含量的高效液相色谱法 （ ＨＰＬＣ ） 和液相色谱  质谱法 （ ＬＣＭＳ ）。 本标准适用于配合饲料 、 浓缩饲料和添加剂预混合饲料 。 ＨＰＬＣ 法为定量测定方法 ， 定量限为 １ｍｇ ／ ｋｇ 。 ＬＣＭＳ 法为定性测定方法 ， 最低检测含量为 ０．５ｍｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 　 动物饲料 　 试样的制备 ３ 　 采样 ３ ． １ 　 采样步骤 ： 按 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 的规定执行 。 ３ ． ２ 　 试样的制备 ： 按 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 的规定执行 。 ４ 　 犎犘犔犆 法 ４ ． １ 　 原理 用乙腈提取饲料中的马杜霉素铵 ， 蒸干提取液用乙腈溶解 ， 用对  二甲氨基苯甲醛溶液进行柱后衍 生 ， ＨＰＬＣ 测定 。 ４ ． ２ 　 试剂和材料 除非另有规定 ， 仅使用分析纯试剂 。 ４ ． ２ ． １ 　 水 ， ＧＢ ／ Ｔ６６８２ ， 一级 。 ４ ． ２ ． ２ 　 甲醇 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ ． ３ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ ． ４ 　 四氢呋喃 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ ． ５ 　 磷酸二氢钾 ： 优级纯 。 ４ ． ２ ． ６ 　 磷酸 ： 优级纯 。 ４ ． ２ ． ７ 　 对  二甲氨基苯甲醛 ： 纯度 ９９％ 。 ４ ． ２ ． ８ 　 硫酸 ： 优级纯 。 ４ ． ２ ． ９ 　 磷酸  磷酸二氢钾缓冲溶液 （ ｐＨ３．０ ）： 准确称取 ２．０４ｇ 磷酸二氢钾 （ ４．２．５ ）， 加 ９００ｍＬ 水溶解 ， 加磷酸 （ ４．２．６ ） 数滴调节 ｐＨ 至 ３．０ ， 转移到 １０００ｍＬ 容量瓶中 ， 用水定容 、 摇匀 。 ４ ． ２ ． １０ 　 流动相 ： 磷酸  磷酸二氢钾缓冲溶液 （ ４．２．９ ） ＋ 四氢呋喃 （ ４．２．４ ） ＋ 甲醇 （ ４．２．２ ） ＝１００＋４０＋８６０ 。 ４ ． ２ ． １１ 　 对  二甲氨基苯甲醛衍生化溶液 ： 准确称取 １６ｇ 对  二甲氨基苯甲醛 （ ４．２．７ ） 于 １０００ｍＬ 棕色 试剂瓶中 ， 加入 ４００ｍＬ 甲醇 （ ４．２．２ ）， 在磁力搅拌器上搅拌至完全溶解后 ， 逐滴加入 ８ｍＬ 硫酸 （ ４．２．８ ）， 继续搅拌至溶液均匀 ， 冷却至室温 ， ２４ｈ 内使用 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２３８７３ — ２００９ ４ ． ２ ． １２ 　 马杜霉素铵贮备溶液 （ １０００ μ ｇ ／ ｍＬ ）： 准确称取 １０７．０ｍｇ （ 精确到 ０．１ｍｇ ） 马杜霉素铵化学对 照品 （ 纯度 ≥ ９３．７％ ） 于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用乙腈 （ ４．２．３ ） 溶解 、 定容 ， 配制成浓度为 １０００ μ ｇ ／ ｍＬ 的贮 备溶液 。 置于 ４℃ ～ ８℃ 冰箱中 ， 有效期为 １ 个月 。 ４ ． ２ ． １３ 　 马杜霉素铵中间溶液 Ⅰ （ １００ μ ｇ ／ ｍＬ ）： 准确移取马杜霉素铵贮备溶液 （ ４．２．１２ ） ５．００ｍＬ 于 ５０ｍＬ 容量瓶中 ， 用乙腈定容 。 置于 ４℃ ～ ８℃ 冰箱中 ， 有效期为 １ 周 。 ４ ． ２ ． １４ 　 马杜霉素铵中间溶液 Ⅱ （ １０．０ μ ｇ ／ ｍＬ ）： 准确移取马杜霉素铵中间溶液 Ⅰ （ ４．２．１３ ） ５．００ｍＬ 于 ５０ｍＬ 容量瓶中 ， 用乙腈定容 。 置于 ４℃ ～ ８℃ 冰箱中 ， 有效期为 １ 周 。 ４ ． ２ ． １５ 　 马杜霉素铵工作溶液 ： 准确移取马杜霉素铵中间溶液 Ⅱ （ ４．２．１４ ） １．００ｍＬ 、 ５．００ｍＬ 于 １０ｍＬ 容量瓶中 ， 马杜霉素铵中间溶液 Ⅰ １．００ｍＬ 、 ５．００ｍＬ 于 １０ｍＬ 容量瓶中 ， 马杜霉素铵贮备溶液 １．００ｍＬ 、 ２．００ｍＬ 、 ３．００ｍＬ 于 １０ｍＬ 容量瓶中 ， 用乙腈稀释 、 定容 ， 配制成浓度分别为 １．００ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ５．００ μ ｇ ／ ｍＬ 、 １０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ５０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 １００ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ２００ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ３００ μ ｇ ／ ｍＬ 的工作溶液 。 现用现配 。 ４ ． ３ 　 仪器 ４ ． ３ ． １ 　 实验室用样品粉碎机 。 ４ ． ３ ． ２ 　 分析天平 ： 感量 ０．１ｍｇ 。 ４ ． ３ ． ３ 　 碘量瓶 ： １５０ｍＬ 。 ４ ． ３ ． ４ 　 超声波清洗器 。 ４ ． ３ ． ５ 　 往复式振荡器 。 ４ ． ３ ． ６ 　 带盖塑料离心管 ： １００ｍＬ 。 ４ ． ３ ． ７ 　 离心机 。 ４ ． ３ ． ８ 　 旋转蒸发仪 ： 配置 １５０ｍＬ 鸡心瓶 。 ４ ． ３ ． ９ 　 旋涡混合器 。 ４ ． ３ ． １０ 　 高效液相色谱仪 ： 具紫外检测器或二极管阵列检测器 。 ４ ． ３ ． １１ 　 柱后衍生系统 。 ４ ． ４ 　 分析步骤 ４ ． ４ ． １ 　 提取 称取约 ５ｇ 试样 （ 精确到 ０．１ｍｇ ） 于碘量瓶 （ ４．３．３ ） 中 ， 加入乙腈 ５０ｍＬ ， 置于超声波清洗器 （ ４．３．４ ） 中超声 １５ｍｉｎ ， 然后置于往复式振荡器 （ ４．３．５ ） 中快速振荡提取 ２０ｍｉｎ 。 转移到离心管 （ ４．３．６ ） 中 ， 用 适量乙腈清洗碘量瓶三次 ， 清洗液合并到离心管中 。 置离心机 （ ４．３．７ ） ４３６０ 犵 离心 ３ｍｉｎ ； 上清液转移 到鸡心瓶 （ ４．３．８ ） 中 ， 在旋转蒸发仪上 ６０℃ 浓缩定容至 ５．００ｍＬ ， 旋涡 （ ４．３．９ ） 混匀 ， 分取适量提取液过 有机滤膜上机测定 。 根据试料溶液中马杜霉素铵的浓度用乙腈进行稀释 ， 使其上机浓度不高于 ３００ μ ｇ ／ ｍＬ 。 ４ ． ４ ． ２ 　 测定 ４ ． ４ ． ２ ． １ 　 液相色谱测定参数的设定 色谱柱 ： Ｃ １８ 柱 ， 柱长 １５０ｍｍ ， 内径 ２．１ｍｍ ， 粒度 ５ μ ｍ 或类似的分析柱 。 柱温 ： ２５℃ 。 检测波长 ： ５８５ｎｍ 。 进样量 ： ２５ μ Ｌ 。 流动相 ： 磷酸  磷酸二氢钾缓冲溶液 （ ｐＨ３．０ ） ＋ 四氢呋喃 ＋ 甲醇 ＝１００＋４０＋８６０ （ ４．２．１０ ）。 流速 ： ０．４ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 ４ ． ４ ． ２ ． ２ 　 柱后衍生系统测定参数的设定 衍生化溶液 ： 对  二甲氨基苯甲醛衍生化溶液 （ ４．２．１１ ）。 衍生化溶液流速 ： ０．５ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 反应器容积 ： １．００ｍＬ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２３８７３ — ２００９ 反应器温度 ： ９０℃ 。 ４ ． ４ ． ２ ． ３ 　 定量测定 在上述仪器条件下 ， 分别注入马杜霉素铵工作溶液 （ ４．２．１５ ） 和试料溶液 （ ４．４．１ ） 进行测定 。 用工作 溶液做单点校准或多点校准 ， 以色谱峰的峰面积进行定量计算 。 ４ ． ５ 　 结果计算 饲料中马杜霉素铵的含量 犡 以质量分数表示 ， 单位为毫克每千克 （ ｍｇ ／ ｋｇ ）， 按式 （ １ ） 计算 ： 犡 ＝ 犃 × 犞 犿 …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犃 ——— 试料溶液中马杜霉素铵峰面积的响应值对应的浓度 ， 单位为微克每毫升 （ μ ｇ ／ ｍＬ ）； 犞 ——— 试料溶液的体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犿 ——— 试料的质量 ， 单位为克 （ ｇ ）。 每个试样取两份试料进行平行测定 ， 以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果 ， 保留三位有效 数字 。 ４ ． ６ 　 重复性 在重复性条件下完成的两个平行测定结果的相对偏差不大于 １０％ 。 ５ 　 犔犆犕犛 法 ５ ． １ 　 原理 用乙腈提取饲料中的马杜霉素铵 ， 提取液蒸干后用乙腈溶解 ， 用 ＬＣＭＳ 测定 。 ５ ． ２ 　 试剂和材料 除非另有规定 ， 仅使用分析纯试剂 。 ５ ． ２ ． １ 　 水 ， ＧＢ ／ Ｔ６６８２ ， 一级 。 ５ ． ２